抑癌基因WWOX與相關(guān)基因p73、Bax在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及意義

陳志英，何 常，李 佽，劉 莉，劉都禮

(1.成都大學(xué)附屬醫(yī)院病理科，四川 成都 610081;2.貴陽醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室，貴州 貴陽 550004)

結(jié)直腸癌是常見的惡性腫瘤之一。在我國，隨著生活水平提高，飲食習(xí)慣改變，結(jié)直腸癌的總體發(fā)病率也呈上升趨勢。大量研究表明，結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展是由多因素引起，多基因參與并經(jīng)歷了多階段的演變過程。本研究應(yīng)用免疫組化法對結(jié)直腸癌中含有WW結(jié)構(gòu)域的氧化還原酶基因(WW domain containing oxidoreductase，WWOX)、p73 及Bax的表達(dá)進(jìn)行研究，探討它們在結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其相互關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 收集貴陽醫(yī)學(xué)院病理科1994～1998年結(jié)直腸癌手術(shù)切除標(biāo)本共計(jì)348份，選取其中臨床及隨訪資料完整并且術(shù)前均未經(jīng)化療和放療的同一組織學(xué)類型及治療方法相同病例的58份標(biāo)本;同時(shí)收集同期結(jié)直腸黏膜炎癥標(biāo)本20份作對照。所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，切片厚4 μm。

1.2 試劑及方法 濃縮型兔抗人多克隆抗體WWOX為英國Abcom公司產(chǎn)品，工作濃度為1∶300;濃縮型鼠抗人單克隆抗體Bax為北京中杉生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，工作濃度為1∶300;濃縮型兔抗人多克隆抗體p73為武漢博士德生物工程有限公司產(chǎn)品，工作濃度為1∶100;Envision二步法免疫組化檢測試劑盒及濃縮型DAB試劑盒均購于北京中杉生物技術(shù)有限公司。所有染色均進(jìn)行高溫高壓抗原修復(fù)。

1.3 結(jié)果判定 主要以細(xì)胞漿染色有清晰淡黃色至棕黃色顆粒為陽性，胞核偶見著色。每張切片于顯微鏡下隨機(jī)觀察10個(gè)高倍視野，計(jì)算陽性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的均值(不足10個(gè)視野的，以可以觀察到的最多高倍視野計(jì)算)。陽性結(jié)果判定根據(jù)以下兩方面的總分進(jìn)行判斷:①選染色均勻的陽性表達(dá)腫瘤區(qū)域，以陽性細(xì)胞所占百分比分五級計(jì)分:陽性細(xì)胞率＜5%計(jì)0分;陽性細(xì)胞率5% ～25%計(jì)1分;陽性細(xì)胞率26% ～50%計(jì)2分;陽性細(xì)胞率51% ～75%計(jì)3分;陽性細(xì)胞率＞75%計(jì)4分。②按染色強(qiáng)度來分:不著色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，黃褐色3分。兩種評分相加，0～1分為陰性(－)，2～7分為陽性(+)。以上方法均由兩名病理醫(yī)師采用雙盲法獨(dú)立檢測，取平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 11.5軟件包進(jìn)行分析，癌組織與炎癥對照組織間蛋白表達(dá)的比較及癌組織中WWOX蛋白表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系用χ2檢驗(yàn)，蛋白間相關(guān)性用χ2關(guān)聯(lián)性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 WWOX、p73、Bax在不同結(jié)直腸組織中的表達(dá) 表1顯示，WWOX在結(jié)直腸癌中的表達(dá)明顯低于炎癥組織，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.900，P＜0.01);Bax在結(jié)直腸癌中的表達(dá)明顯低于炎癥組織，兩組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.572，P＜0.05);p73在結(jié)直腸癌中的表達(dá)明顯高于炎癥組，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.866，P ＜0.01)。

表1 結(jié)直腸癌及結(jié)直腸黏膜炎癥中WWOX、p73及Bax的表達(dá)

2.2 WWOX、p73、Bax表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征之間的關(guān)系 表2顯示，WWOX在結(jié)直腸癌中的表達(dá)與浸潤深度(χ2=6.169，P ＜ 0.05)及預(yù)后(χ2=9.893，P ＜ 0.01)密切相關(guān)，與年齡、性別及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)(P＞0.05)。p73在結(jié)直腸癌中的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(χ2=4.315，P ＜ 0.05)及浸潤深度(χ2=4.207，P ＜ 0.05)相關(guān)，而與患者的年齡、性別及預(yù)后無關(guān)(P＞0.05)。Bax在結(jié)直腸癌中的表達(dá)與患者的預(yù)后相關(guān)(χ2=5.545，P ＜ 0.05)，與患者的年齡、性別、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及浸潤深度無關(guān)(P＞0.05)。

表2 WWOX、p73及Bax的表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征之間的關(guān)系

2.3 結(jié)直腸癌組織中WWOX與p73及Bax表達(dá)的相關(guān)性 WWOX陽性表達(dá)的15例結(jié)直腸癌組織中有10例p73表達(dá)陽性，13例Bax表達(dá)陽性，χ2關(guān)聯(lián)性分析表明WWOX與p73的表達(dá)無相關(guān)性(P＞0.05)，與Bax的表達(dá)呈正相關(guān)(P＜0.05)，見表3。

表3 結(jié)直腸癌組織中WWOX與p73、Bax表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

WWOX基因是Bednarek等［1］在2000年應(yīng)用鳥槍基因測序技術(shù)結(jié)合對感興趣區(qū)域?qū)?yīng)的轉(zhuǎn)錄子進(jìn)行分離并分析的方法鑒定得到的一個(gè)新的包含有FRA16D的基因，跨越了基因組內(nèi)一個(gè)大于100萬bp的區(qū)域，這個(gè)區(qū)域位于染色體的16q23.3～q24.1(普通型脆性位點(diǎn)，F(xiàn)RA16D)。

目前人們通過研究已經(jīng)在肺小細(xì)胞肺癌、胰腺癌、膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、食管鱗狀上皮細(xì)胞癌等多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)了WWOX的表達(dá)異常，推測WWOX基因?yàn)樾碌哪[瘤相關(guān)基因［1～6］。本研究我們應(yīng)用免疫組化方法檢測了結(jié)直腸癌組織及結(jié)直腸黏膜炎癥組織中WWOX蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示W(wǎng)WOX在癌組織中的表達(dá)明顯低于炎癥組織，這與其他相關(guān)報(bào)道一致，提示W(wǎng)WOX蛋白的低表達(dá)可能在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中起了重要作用。另外，試驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)WWOX在結(jié)直腸癌中的表達(dá)與腫瘤的浸潤深度及患者的預(yù)后密切相關(guān)(P＜0.05，P＜0.01)。目前WWOX蛋白在人腫瘤中的詳細(xì)作用機(jī)制還不清楚，但有研究表明在鼠的體內(nèi)與WWOX基因功能及結(jié)構(gòu)類似的基因(WOX1)已被證實(shí)是腫瘤壞死因子(TNF-α)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程中必不可少的中介物。WOX1位于細(xì)胞的線粒體內(nèi)，TNF通過誘導(dǎo)線粒體膜通透性的改變導(dǎo)致WOX1從線粒體釋放，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。根據(jù)人和鼠間的高度同源性，我們分析當(dāng)WWOX蛋白低表達(dá)甚至失活時(shí)，影響了TNF的作用過程，從而降低或喪失對細(xì)胞凋亡的控制，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。

作為p53家族的成員之一，p73蛋白與P53蛋白在序列上具有同源性，也能夠誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和凋亡。Jost等［7］將野生型p73轉(zhuǎn)染SAOS2細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞發(fā)生了明顯的凋亡，而轉(zhuǎn)染p73突變體的細(xì)胞株卻沒有這種現(xiàn)象。因此人們推測p73是一抑癌基因。然而最近的研究發(fā)現(xiàn)，p73在很多腫瘤組織中高表達(dá)，在相應(yīng)的正常組織中低表達(dá)。Kang等［8］研究表明，在正常胃組織和4/5的研究細(xì)胞系中p73極低水平表達(dá)，但37/39的癌組織中p73明顯升高。另外人們在肝細(xì)胞癌、肺癌等也檢測到高水平表達(dá)的p73，但對其高水平表達(dá)的機(jī)制及其是否為抑癌基因仍不是很清楚。本次試驗(yàn)結(jié)果顯示p73在結(jié)直腸癌組織中過度表達(dá)，顯著高于炎癥組，且與浸潤深度成正相關(guān)(P＜0.05);在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組p73陽性表達(dá)率也明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(P＜0.05)。我們認(rèn)為，p73在結(jié)直腸癌中的過度表達(dá)與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，p73可作為結(jié)直腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要指征。

Bax是Bcl-2家族中最重要的促凋亡蛋白，Bcl-2家族在細(xì)胞凋亡的調(diào)控中扮演了重要的角色。Sarbia等［9］對食管癌的研究顯示Bax在食管癌的表達(dá)明顯低于正常食管上皮，并且隨著腫瘤分化程度的下降而減低。Marx等［10］檢測了215例卵巢癌的Bax表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)Bax的陽性率為47%，明顯低于正常組織。我們的結(jié)果和其他報(bào)道一致，同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)Bax的表達(dá)與預(yù)后關(guān)系密切，高表達(dá)預(yù)示患者的預(yù)后好，生存期長。我們推測Bax基因的檢測對于結(jié)直腸癌的預(yù)后診斷有一定的參考意義。

WWOX基因由9個(gè)外顯子構(gòu)成，其ORF長度為1245bp，編碼一個(gè)長414個(gè)氨基酸，46kDa的蛋白［11］。研究發(fā)現(xiàn)WWOX蛋白可同多種蛋白相互作用。Aqeilan等［12］就報(bào)道了人的 WWOX可直接在胞漿中通過第一WW結(jié)構(gòu)域與p73的482PPPP Y488基序互相作用，形成結(jié)合復(fù)合物產(chǎn)生促凋亡作用。本次試驗(yàn)顯示W(wǎng)WOX與p73的表達(dá)無相關(guān)性(P＞0.05)。國外學(xué)者通過研究發(fā)現(xiàn)WWOX與p73共同轉(zhuǎn)染時(shí)可增強(qiáng)細(xì)胞凋亡，單獨(dú)轉(zhuǎn)染也能引起細(xì)胞凋亡，由此推測在人體內(nèi)應(yīng)該存在一條獨(dú)立于p73的關(guān)于WWOX促細(xì)胞凋亡的途徑，在結(jié)直腸癌中WWOX可能主要通過該途徑來發(fā)揮其對腫瘤細(xì)胞的促凋亡作用，因此在結(jié)直腸癌組織中兩者未體現(xiàn)出相關(guān)性。

另外，有文獻(xiàn)報(bào)道WWOX蛋白主要位于線粒體，WWOX通過下調(diào)凋亡抑制因子Bcl-2和Bcl-xl及上調(diào)P53的表達(dá)增強(qiáng)TNF的細(xì)胞毒性功能，而TNF通過促使線粒體通透性的改變而導(dǎo)致WWOX從線粒體釋放入核內(nèi)，起促凋亡的作用。Bax是Bcl-2家族中最重要的促進(jìn)凋亡蛋白，此次研究發(fā)現(xiàn)WWOX與 Bax有協(xié)同作用(χ2=6.561，P ＜ 0.05)，我們推測WWOX可能通過上調(diào)Bax的表達(dá)等一系列相同的作用方式促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。因此聯(lián)合檢測兩者在結(jié)直腸癌中的表達(dá)可能對其預(yù)后的診斷有著重要的作用。

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