1株鴿新城疫病毒的分離、鑒定及生物學(xué)特性研究

仇微紅 葉賀佳李 敏 孫招金 王鑫 梁昭平,2 羅開健

（1 廣州市華南農(nóng)大生物藥品有限公司 廣州 511300 2 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院 廣州 510642）

鴿Ⅰ型副黏病毒（Pigeon Paramyxovirus 1，PPMV-Ⅰ）病又稱鴿瘟或鴿新城疫，是一種由禽Ⅰ型副黏病毒引起的、流行于鴿群的高度接觸性急性傳染病，它以腸炎、嚴(yán)重腹瀉和神經(jīng)癥狀為特征，是危害養(yǎng)鴿業(yè)的主要疫病之一[1]。筆者從廣東某鴿場發(fā)病鴿中分離到了1株新城疫病毒，通過血清學(xué)試驗(yàn)進(jìn)行了鑒定，并對(duì)該毒株進(jìn)行了毒力指標(biāo)測定 (ICPI、IVPI和MDT)、動(dòng)物回歸試驗(yàn)以及組織病理學(xué)觀察。現(xiàn)將試驗(yàn)結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)雞胚

10日齡SPF胚，購自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物

30日齡雛鴿，購自江門市翔勝鴿場。

1.1.3 標(biāo)準(zhǔn)陽性血清

新城疫病毒、禽流感病毒（H5、H7、H9亞型）、EDSV76標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2 方法

1.2.1 病毒分離

1.2.1.1 病料采集

在廣東省某大型鴿場某鴿群發(fā)生了臨床癥狀以神經(jīng)癥狀、腹瀉為主的傳染病，病死率很高，尤其以1月齡以內(nèi)的雛鴿發(fā)病嚴(yán)重，死亡率達(dá)83%。病鴿排綠色或黃綠色的水樣糞便，呈現(xiàn)頭頸后仰（觀星狀）、歪頭、扭頸、翅膀麻痹等神經(jīng)癥狀。剖檢病死鴿發(fā)現(xiàn)腺胃、肌胃出血，胰臟有白色壞死點(diǎn)，肝臟出血，腦充血出血，采集了病死鴿的腦、胰臟、肝臟和肺臟做病原分離與鑒定。

1.2.1.2 病料處理

取死亡鴿子的腦、胰臟、肝臟和肺臟剪碎，研磨，加入適量PBS液，反復(fù)凍融3次，離心，取上清，按終濃度分別為1000IU/mL的青霉素和鏈霉素，置4℃過夜，0.22μm濾器過濾，濾液用于接種雞胚。

1.2.1.3 雞胚接種及血凝性

病料濾過液接種10個(gè)10日齡SPF雞胚，每胚接種0.2mL；去除24h內(nèi)非特異死亡雞胚，收集24～72h內(nèi)死亡胚的尿囊液。測定尿囊液是否有血凝性，并盲傳6代，每代測HA效價(jià)。

1.2.2 血凝抑制（HI）試驗(yàn)

以常規(guī)方法測定F2、F6代尿囊液的HA效價(jià)，并以抗ND、禽流感 (H5、H7、H9亞型)、EDSV76標(biāo)準(zhǔn)陽性血清進(jìn)行血凝抑制（HI）試驗(yàn)。首先將收獲的尿囊液配成4HAU抗原，取96孔V型微量反應(yīng)板，每孔加入25μL生理鹽水，第1排加25 μL標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，每種血清做2個(gè)重復(fù)，然后將血清進(jìn)行2倍系列稀釋至第10孔，從第10孔吸取25μL棄去。稀釋后每排第1～11孔再加入25μL4HAU抗原，反應(yīng)5～10min，最后加入1%紅細(xì)胞懸液25μL，用微量振蕩器混勻，室溫下靜置30～40min。

1.2.3 病毒ELD50的測定

將分離的病毒尿囊液F6代用無菌生理鹽水作10倍系列稀釋，取10-6～10-105個(gè)稀釋度分別經(jīng)尿囊腔途徑接種5枚10日齡的SPF雞胚，0.1mL/胚，置37℃孵育96h，24h前死胚為非特異性死亡，廢棄不計(jì)，記錄24～96h內(nèi)死亡雞胚，按Reed-Muench法計(jì)算其ELD50。

1.2.4 毒力的測定

1.2.4.1 腦內(nèi)接種致病指數(shù)（ICPI）測定

將分離的病毒尿囊液F6代以滅菌生理鹽水稀釋10倍，腦內(nèi)注射出殼后24～36h的SPF雛雞10只，每只0.05mL，同時(shí)設(shè)5只對(duì)照（腦內(nèi)注射滅菌生理鹽水0.05mL），隔離飼養(yǎng)，觀察8d[2]。記錄正常、發(fā)病與死亡雞的每日累計(jì)數(shù)，正常雞積分為0、發(fā)病為1、死亡為2，最后計(jì)算ICPI，ICPI=（8d累計(jì)發(fā)病數(shù)×1+8d累計(jì)死亡數(shù)×2）/8d累計(jì)雞只總數(shù)。

1.2.4.2 靜脈接種致病指數(shù)（IVPI）測定

將分離毒種F6代以滅菌生理鹽水稀釋10倍，翅靜脈接種42d SPF雞10只，每只0.1mL，同時(shí)設(shè)5只對(duì)照（靜脈注射滅菌生理鹽水0.1mL），隔離飼養(yǎng)，觀察10d。記錄正常、發(fā)病、麻痹與死亡雞的每日累計(jì)數(shù)，正常雞積分為0、發(fā)病為1、麻痹為2、死亡為3，最后計(jì)算 IVPI[2]，IVPI=（10d累計(jì)發(fā)病數(shù)×1+10d累計(jì)麻痹數(shù)×2+10d累計(jì)死亡數(shù)×3）/10d累計(jì)雞只總數(shù)。

1.2.4.3 MDT測定

將分離的病毒尿囊液F6代以滅菌生理鹽水分別稀釋成10-5～10-9，每個(gè)稀釋度分別接種9日齡SPF雞胚10枚，每胚0.1mL，37℃繼續(xù)孵化，棄去24h內(nèi)的死胚，以后每天照蛋3次，記錄胚胎殘廢時(shí)間，取尿囊液測定HA效價(jià)，持續(xù)7d，取全部致死雞胚的最大稀釋度死胚的記錄，計(jì)算MDT[2]，MDT=（Xh×Xh死亡胚數(shù)+Yh×Yh死亡胚數(shù)）/死亡胚總數(shù)。

1.2.5 動(dòng)物回歸試驗(yàn)及病理切片觀察

F6代病毒尿囊液經(jīng)10-2稀釋，通過滴鼻和肌肉注射的方式對(duì)30日齡左右的10只雛鴿進(jìn)行攻毒，肌肉注射0.5mL/只。另設(shè)5只健康鴿作為空白對(duì)照。攻毒后觀察每組鴿的發(fā)病和死亡情況，觀察2周，并對(duì)發(fā)病及死亡鴿做組織病理學(xué)觀察。

2 結(jié)果

2.1 病毒分離、鑒定結(jié)果

2.1.1 各代次雞胚尿囊液HA效價(jià)

病料濾過液接種的10枚SPF胚中，有6枚于24～72h內(nèi)死亡，胚體充血、出血，逐胚測定各代次雞胚尿囊液HA效價(jià)，F(xiàn)1～F6各代尿囊液平均HA效價(jià)分別為 23.6、25.3、26.5、27.2、28.3、210.0。

2.1.2 血凝抑制（HI）試驗(yàn)結(jié)果

雞胚尿囊液血凝性僅被NDV的標(biāo)準(zhǔn)陽性血清所抑制，而不被禽流感（H5、H7、H9亞型）及EDS76標(biāo)準(zhǔn)陽性血清所抑制。

2.2 F6代病毒尿囊液病毒含量的測定結(jié)果

經(jīng)測定，該分離株的ELD50為10-8.60/0.1mL。

2.3 毒力的測定結(jié)果

經(jīng)測定，該分離株的ICPI為1.64，IVPI為2.2，MDT為 44.1h。

2.4 動(dòng)物回歸實(shí)驗(yàn)結(jié)果

攻毒后4d，所有試驗(yàn)鴿精神沉郁，出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，表現(xiàn)頭頸后仰（觀星狀）、歪頭、扭頸及翅膀麻痹等，肛門周圍粘滿綠色糞便。剖檢可見肌胃、腺胃出血，腸黏膜出血，里面充滿黃色黏液，腦部也見輕微出血。組織病理學(xué)觀察腦部腦膜充血瘀血，血管周圍間隙增寬，淋巴細(xì)胞浸潤；脾臟瘀血，大量漿細(xì)胞聚焦；肝臟瘀血；腸道固有層大量漿細(xì)胞浸潤；氣管分泌旺盛，固有層瘀血，炎癥細(xì)胞浸潤（圖1～5）。

3 小結(jié)與討論

3.1 根據(jù)從發(fā)病鴿中分離到病毒具有血凝性，且能被抗NDV血清所抑制，而不被禽流感（H5、H7、H9亞型）及EDSV76標(biāo)準(zhǔn)陽性血清所抑制，以及動(dòng)物回歸試驗(yàn)結(jié)果及組織病理學(xué)檢查結(jié)果可以判定鴿群感染了新城疫病毒，病毒和以往報(bào)道[3-5]的關(guān)于鴿新城疫病毒的特性相一致。

圖1 腦部病理組織變化

圖3 肝臟病理組織變化

圖4 腸道病理組織變化

圖5 氣管病理組織變化

3.2 目前用于評(píng)價(jià)新城疫病毒毒力強(qiáng)弱的指標(biāo)主要有 MDT、ICPI、IVPI，強(qiáng)毒的 MDT小于 60h，ICPI在1.5～2.0之間，IVPI在2.0～3.0之間。本研究中分離株的 ICPI為 1.64、IVPI為 2.2、MDT為 44.1h，符合強(qiáng)毒的標(biāo)準(zhǔn)。

3.3 鴿新城疫病毒感染為危害養(yǎng)鴿業(yè)的最主要的疾病之一，但對(duì)本病迄今尚無特異性的有效治療藥物，關(guān)鍵在于預(yù)防。盡管鴿新城疫病毒與雞的新城疫病毒為同一屬，但許多報(bào)道表明用現(xiàn)有的雞新城疫疫苗免疫鴿群后保護(hù)效果并不理想[6]。因此，分離、培育出免疫原性良好的毒株，研制出具有良好免疫效力的鴿用新城疫疫苗對(duì)預(yù)防本病至關(guān)重要。本研究中分離株的基因分型以及其免疫原性等有待進(jìn)一步的研究。

[1]Kaleta E F，Alexander D J，Russell P H.The first isolation of the PPMV-I virus responsible for the current panzootic in pigeons [J].Avian poulty，1985，14：553-557.

[2]國際獸醫(yī)局(OIE)推薦的《動(dòng)物疫病診斷方法和生物制品要求手冊(cè)》[M].1992,31-37.

[3]何葉峰，秦卓明，賈強(qiáng).鴿I型副黏病毒的分離和鑒定[J].中國獸醫(yī)雜志，2002，38（11）.

[4]鄒永新，劉思伽.鴿I型副黏病毒病的病原特性[J].Poultry Science，2005，10：47-49.

[5]賀東生，姜崢嶸，陳學(xué)杰，等.鴿I型副黏病毒的分離和鑒定[J].中國動(dòng)物防疫，2001，18（9）：26-28.

[6]張淑霞，楊增歧，趙余放，等.鴿新城疫油乳佐劑滅活苗對(duì)鴿免疫效果觀察 [J]. 中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，1999，21(3)：163-165.