薛 楓，張 波，姚 昆，王文文，高相艷，劉麗麗

（1天津師范大學(xué)a.生命科學(xué)學(xué)院，b.天津市細(xì)胞遺傳與分子調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津，300387；2.天津市濱海新區(qū)大港農(nóng)業(yè)服務(wù)中心，天津300270）

近年來，隨著現(xiàn)代畜禽養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，我國(guó)已成為世界畜禽養(yǎng)殖大國(guó).這一發(fā)展趨勢(shì)在帶來巨大經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益的同時(shí)，也產(chǎn)生了嚴(yán)重的環(huán)境污染問題，尤其是畜禽糞便造成的污染，成為亟需解決的難題[1].農(nóng)業(yè)畜禽養(yǎng)殖過程中產(chǎn)生的大量排泄物，成分復(fù)雜，除了含有多種營(yíng)養(yǎng)元素外，還含有很多病原菌、寄生蟲卵、重金屬等，并且容易產(chǎn)生溫室氣體和有害氣體[2].由于畜禽糞便總量過大，已經(jīng)成為一個(gè)巨大的集中污染物來源，我國(guó)農(nóng)村43%的環(huán)境污染來自于此[3].尋求安全、經(jīng)濟(jì)且實(shí)際可行的畜禽糞便處理方法[4]成為解決這一難題的關(guān)鍵因素和當(dāng)前研究的熱點(diǎn).

臭氣污染是畜禽糞便污染中重要的一個(gè)方面.惡臭物質(zhì)成分復(fù)雜，從組成上通?？煞譃?類：（1）含硫化合物、如硫化氫、硫醇類等；（2）含氮化合物，如氨、胺類等；（3）鹵素及其衍生物；（4）烴類，如甲烷.惡臭作為環(huán)境公害之一，直接影響人們的生活質(zhì)量，甚至危害到人們的健康，也制約著畜禽業(yè)自身的可持續(xù)發(fā)展[5].惡臭物質(zhì)中的氨氣（NH3）和硫化氫（H2S）還具有強(qiáng)烈的毒性，濃度大時(shí)，能使人畜中毒.因此，如何控制畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)產(chǎn)生的惡臭，是當(dāng)今養(yǎng)殖場(chǎng)在環(huán)境方面需要重視的問題，也是國(guó)內(nèi)外畜牧工作者研究的重要課題之一.

目前，有效處理排泄物中惡臭物質(zhì)的方法很多，包括物理、化學(xué)和生物方法，其中生物方法具有廣闊的應(yīng)用前景.在排泄物處理過程中，人們很早就意識(shí)到微生物的作用，尤其是在降解各種引起惡臭的成分方面[6]，如一些具有氧化硫化物能力的微生物，它在生物除臭過程中能起到關(guān)鍵作用[7].

生物除臭法是20世紀(jì)50年代后期才發(fā)展起來的，該方法利用微生物的生理代謝作用降解惡臭物質(zhì)使之無臭化、無害化，具有成本低廉、肥效高、易于推廣和無二次污染等優(yōu)勢(shì)[8]，且經(jīng)過微生物處理的排泄物，肥效會(huì)明顯提高.若在堆肥基質(zhì)中添加可加快基質(zhì)分解速度的除臭微生物，則既能加快堆肥腐熟進(jìn)程，又能有效減少臭味的逸出，對(duì)控制環(huán)境污染具有重要作用.馮健等[9]利用自主分離和引進(jìn)的菌株對(duì)糞便進(jìn)行了處理，發(fā)現(xiàn)具有良好的除臭效果.陳麗園等[10]從養(yǎng)殖場(chǎng)周圍土壤中分離并篩選到一些菌株，將活菌制劑直接加入新鮮雞糞，篩選到既能減少NH3排放、也能減少H2S排放的菌株.劉春梅等[11]篩選到耐高溫的除臭菌株，研究其對(duì)NH3和H2S釋放量及物質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響，結(jié)果表明除臭菌株能有效減少NH3和H2S的釋放，保留氮素和硫素養(yǎng)分.高穎等[12－13]研究了不同種類的微生物減少豬糞臭氣釋放的效果，其中嗜酸乳桿菌和短小芽孢桿菌對(duì)NH3去除效果較好；細(xì)黃鏈霉菌、米根霉和班圖酒香酵母菌對(duì)H2S的去除效果較好.并將不同種類的菌株混合，研究其對(duì)豬糞的除臭效果，結(jié)果表明以細(xì)菌、放線菌和真菌混合的生物除臭劑除臭效果最好.

本課題以實(shí)驗(yàn)室保存的8種菌株為材料，分析其對(duì)豬糞樣品中NH3和H2S釋放量的影響，評(píng)價(jià)各菌株對(duì)豬糞的除臭效果，為微生物除臭技術(shù)提供理論和技術(shù)支持，并測(cè)定糞便樣品的有效磷含量，初步研究微生物菌劑對(duì)糞便肥力的影響.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

糞樣與菌株：新鮮豬糞樣品取自天津市西青區(qū)精武鎮(zhèn)養(yǎng)豬場(chǎng)；供試菌株（1、2、14、B1、W－1、PY、PI、Dn－101）均來自于天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室（姚昆篩選、保存）.

培養(yǎng)基：1L牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基（牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，瓊脂15g，pH7.0～7.2）；1L牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基（牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，pH7.0～7.2）.

實(shí)驗(yàn)試劑：NH3吸收液（0.005mol／L硫酸溶液）；H2S吸收液（硫酸鎘 4.3g／L、氫氧化鈉0.3g／L、聚乙烯醇磷酸銨10g／L.使用時(shí)將3種試劑分別溶于水中，混合后強(qiáng)烈振搖至完全混勻，貯于4℃冰箱中可保存1周）.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 液體菌劑的制備

將純化復(fù)壯的8個(gè)菌株（1、2、14、B1、W－1、PY、PI、Dn－101）分別接種于裝有10mL無菌牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基的試管中，于37℃、120r／min條件下培養(yǎng)48h，得到相應(yīng)菌株的液體菌劑，4℃保存?zhèn)溆?

1.2.2 NH3和 H2S的吸收測(cè)定

稱取新鮮豬糞樣品50g放入1L燒杯中，將8個(gè)菌株的液體菌劑10mL分別與燒杯中的新鮮豬糞充分混勻，以10mL無菌水作為空白對(duì)照，并在每個(gè)燒杯中放入分別裝有NH3吸收液（20mL）和H2S吸收液（20mL）的小燒杯.將大燒杯密封，于37℃恒溫避光培養(yǎng)5d，然后測(cè)定NH3和H2S的釋放量.本實(shí)驗(yàn)采用次氯酸鈉—水楊酸分光光度法[14]測(cè)定NH3的釋放量、聚乙烯醇磷酸銨吸收—亞甲基藍(lán)比色法[15]測(cè)定H2S的釋放量.實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù).

1.2.3 有效磷測(cè)定

將菌劑處理后的糞便樣品自然風(fēng)干，研磨成粉末并過孔徑為2mm篩，80℃烘干12h，測(cè)定樣品中有效磷的含量.本實(shí)驗(yàn)采用鉬銻抗比色法[16]測(cè)定有效磷含量.實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)重復(fù).

1.2.4 菌株的革蘭氏染色鏡檢

將菌株2、B1和PI分別接種于無菌牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)12h和24h后，進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢[17].

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌劑處理后豬糞樣品NH3的釋放量

不同菌劑處理后豬糞樣品中NH3的釋放量見表1，去除率見圖1.菌株1、2處理豬糞樣品后，同對(duì)照相比，NH3的釋放量顯著下降，去除率分別為56.99%和53.31%，表現(xiàn)出明顯的除臭效果；菌株14的除臭效果略好于對(duì)照；其他5個(gè)菌株處理豬糞樣品后，NH3的釋放量反而上升，尤其是PY和Dn－101，釋放量顯著高于對(duì)照，去除率分別為－100.37% 和－51.10%.因此認(rèn)為這5個(gè)菌株對(duì)NH3的釋放不但沒有抑制作用，反而會(huì)促進(jìn)其釋放.

表1 不同菌劑處理后豬糞樣品NH3的釋放量Tab.1 NH3released content of pig feces samples under the treatments of different bacterial reagents mg／L

圖1 不同菌劑處理后豬糞樣品NH3和H2S的去除率Fig.1 NH3and H2S removal rate of the pig feces samples under the treatments of different bacterial reagents

2.2 不同菌劑處理后豬糞樣品H2S釋放量

不同菌劑處理后豬糞樣品中H2S的釋放量見表2，去除率見圖1.菌株14、B1、W－1和Dn－101能明顯抑制豬糞樣品中H2S的釋放，釋放量分別為9.231、16.948、17.264和20.047mg／L，去除 率 分 別 為 81.64%，66.29%，65.66% 和60.13%；菌株P(guān)Y、2對(duì)豬糞樣品中H2S的釋放有微弱的促進(jìn)作用；菌株P(guān)I、1對(duì)豬糞H2S的釋放有顯著促進(jìn)作用，尤其是PI菌株，釋放量高達(dá)74.569mg／L，顯 著 高 于 對(duì) 照 處 理， 去 除 率 為－48.30%.

表2 不同菌劑處理后豬糞樣品H2S的釋放量Tab.2 H2S released content of the pig feces samples under the treatments of different bacterial reagents mg／L

2.3 不同菌劑處理后豬糞有效磷的含量

不同菌劑處理后豬糞樣品的有效磷含量見表3，有效磷增加率見圖2.經(jīng)菌株2、PI和B1處理后，豬糞樣品的有效磷含量同對(duì)照相比明顯增加，尤其是經(jīng)菌株2處理后，有效磷質(zhì)量濃度達(dá)到3 423mg／L，增加率為55.59%.菌株P(guān)I和B1也能在一定程度上促進(jìn)有效磷的生成.經(jīng)菌株Dn－101處理后的有效磷含量略有增加.但菌株P(guān)Y和W－1處理后的有效磷含量顯著下降，增加率為－66.64%和 －45.09%，顯著抑制了有效磷的生成.

表3 不同菌劑處理后豬糞樣品的有效磷含量Tab.3 Available－phosphorus content of the pig feces samples under the treatments of different bacterial reagents mg／L

圖2 不同菌劑處理后豬糞樣品的有效磷增加率Fig.2 Available－phosphorus increasing rate of the pig feces samples under the treatments of different bacterial reagents

2.4 菌株革蘭氏染色鏡檢結(jié)果

根據(jù)上述結(jié)果，菌株2、B1和PI的除臭效果和增加肥力的效果明顯.將這3株菌株經(jīng)12h和24h培養(yǎng)后進(jìn)行革蘭氏染色，油鏡下觀察并進(jìn)行顯微拍照（10×100倍，結(jié)果見圖3）.

革蘭氏染色是鑒定和分類細(xì)菌的重要方法，根據(jù)染色后細(xì)菌呈現(xiàn)的顏色，可將所有細(xì)菌區(qū)分為兩大類：染色后呈藍(lán)紫色的細(xì)菌為革蘭氏陽性細(xì)菌，用G＋表示；染色后呈紅色的細(xì)菌為革蘭氏陰性細(xì)菌，用G－表示.細(xì)菌在革蘭氏染色中呈現(xiàn)不同顏色，是由于細(xì)胞壁的成分和結(jié)構(gòu)不同.由圖3可知，菌株2、B1和PI均為革蘭氏陽性菌.

圖3 菌株的革蘭氏染色鏡檢結(jié)果Fig.3 Gram stain result of the bacterial strain

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，菌株1、2能明顯抑制豬糞中NH3的釋放，去除率達(dá)50%以上；菌株14、B1、W－1和Dn－101能明顯抑制豬糞中H2S的釋放，去除率均高于60%，具有良好的去除效果；菌株2、B1和PI處理后糞肥有效磷含量明顯增加，增加率分別為55.59%、26.82%和27.23%，對(duì)糞肥的肥力有良好的促進(jìn)作用.綜合比較，菌株2和B1對(duì)惡臭物質(zhì)的去除效果和糞肥肥力的增加效果比較明顯，可作為處理豬糞的候選微生物.

不同的菌株對(duì)于豬糞中含氮和含硫有機(jī)物的作用機(jī)理不同.有的菌株分解含氮或含硫有機(jī)物，并促進(jìn)氮或硫轉(zhuǎn)化為NH3和H2S，從而形成惡臭氣體；有些菌株促進(jìn)含氮或含硫有機(jī)物轉(zhuǎn)化為含氮或含硫的無機(jī)鹽，這些機(jī)理造成不同菌株對(duì)豬糞的除臭效果差異明顯.不同菌株對(duì)豬糞的肥力影響也不相同，可能是由于各菌株對(duì)豬糞中各種形式的磷化物作用機(jī)理不同，如將糞便中大量的有機(jī)磷通過水解等方式轉(zhuǎn)化成無機(jī)磷酸鹽，則有效磷含量明顯提高.各菌株的除臭機(jī)理及提高豬糞肥力的機(jī)理還有待于深入研究，且各菌株還需進(jìn)一步鑒定.單一菌株對(duì)NH3和H2S的去除效果相差很大，這是單一微生物除臭劑要解決的問題之一.期望在以后的工作中，能夠得到兼具高效去除NH3和H2S等惡臭氣體的微生物，為微生物除臭技術(shù)提供更多的理論和技術(shù)支持.

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