重慶彭水野生美味牛肝菌菌絲分離與鑒定*

王正春，蔣海艷，楊笑笑，李月文，李繼暉，鄭凌凌

（1.重慶市林業(yè)科學(xué)研究院，重慶 400036；2.西南大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，重慶 400715；3.彭水自治縣林業(yè)科技推廣站，四川 彭水 409600）

牛肝菌屬是擔(dān)子菌亞門（Basidiomycotina）、層菌綱（Hymenomycete）、 傘菌目（Agaricales）、 牛肝菌科（Boletaceae）的一類珍稀大型菌根食用真菌。重慶生長的牛肝菌以彭水 “大腳菌”即美味牛肝菌最有名氣，味道鮮美，營養(yǎng)豐富，具有高經(jīng)濟(jì)價值。市場上消費(fèi)的美味牛肝菌主要是野生，目前尚未見人工栽培的報道。近年來，由于人們過度采集及不合理采集，野生資源正逐年減少，為使這一寶貴資源得到可持續(xù)利用，對其采取保護(hù)措施和人工馴化繁育勢在必行。通過對重慶武陵山區(qū)彭水野生美味牛肝菌菌絲的分離培養(yǎng)，為美味牛肝菌的菌根菌合成和人工馴化作好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 分離材料

白牛肝菌，菌蓋淡褐色，菌褶白色，菌柄粗壯，淡黃色；黃牛肝菌，菌蓋為黃褐色，菌柄為烤面包的皮殼色。2種子實(shí)體，于2011年6月18日采摘于重慶武陵山彭水朗溪鄉(xiāng)青岡純林內(nèi)，海拔為700 m左右。2種牛肝菌的子實(shí)體情況見圖1。

圖1 2種牛肝菌的子實(shí)體情況

1.1.2 培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基：①葡萄糖 20 g、酵母粉 7.0 g、黃豆粉3.0 g、 KH2PO41.0 g、 MgSO4·H2O 0.5 g、 MgSO4·7H2O 0.5 g、瓊脂 20.0 g，水 1000 mL[1]；②馬鈴薯 200 g、葡萄糖20 g、 KH2PO43 g、 MgSO4·7H2O 1.5 g、 瓊脂 20 g、 VB110 mg，水 1000 mL。

液體培養(yǎng)基：③葡萄糖 20 g、麥芽糖5 g、KH2PO41 g、 MgSO4·7H2O 0.5 g、 VB11 mL，水 1000 mL，pH 6.0；④葡萄糖 20 g、 酵母浸出膏 7.0 g、MgSO4·7H2O 1.0 g、KH2PO42.0 g、 VB10.01 mg，水 1000 mL，pH 5.2～5.8[2]。

1.2 方法

1.2.1 菌絲分離、培養(yǎng)

采摘的子實(shí)體放入干凈、透氣的盒子，立即帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理。選取新鮮幼嫩、無病蟲害的完整子實(shí)體，采用組織分離法，無菌操作，及時進(jìn)行分離。子實(shí)體表面用75%酒精進(jìn)行消毒，然后切取菌柄與菌蓋交界處[3]大小為(0.2×0.2)cm～(0.4×0.4)cm的組織塊接入培養(yǎng)基中，分別做好標(biāo)記，并注明日期，放入恒溫恒濕培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。盡可能將組織塊接入較多的斜面培養(yǎng)基。培養(yǎng)條件為25℃，相對濕度70%，無光照。4 d～5 d后檢查培養(yǎng)基斜面是否有污染，有污染者及早剔除。

菌絲生長旺盛時，挑取少許菌絲轉(zhuǎn)接到新的培養(yǎng)基中，標(biāo)注后，放入恒溫恒濕培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。整個轉(zhuǎn)接過程在無菌的環(huán)境下進(jìn)行，每隔2 d檢查，剔除污染嚴(yán)重的培養(yǎng)基。

1.2.2 液體培養(yǎng)

液體培養(yǎng)基配制好后，進(jìn)行分裝。100 mL三角瓶裝液量為40 mL，高壓滅菌121.1℃、30 min，冷卻后保存于冰箱備用。挑取少許健壯的菌絲接入液體培養(yǎng)基中，注明菌種名稱、編號、日期。在27℃條件下靜置24 h后，放入恒溫震蕩箱中進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為27℃、轉(zhuǎn)速為160 r·min-1。

1.2.3 菌絲鑒定

菌絲經(jīng)過液體培養(yǎng)后。將三角瓶中的液體及菌絲過濾，進(jìn)行ITS鑒定[4]，具體方法跟 “武陵山區(qū)羊肚菌菌絲鑒定及分析”中羊肚菌菌絲鑒定相同。以ITS1和ITS4為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到的rDNA-ITS區(qū)段經(jīng)過測序后，登陸www.ncbi.nlm.nih.gov進(jìn)行BLAST比對。

1.2.4 菌種保藏

菌絲體經(jīng)過鑒定，確認(rèn)為美味牛肝菌后，進(jìn)行低溫冷凍保藏。具體方法：信封高溫滅菌、濾紙進(jìn)行高溫滅菌待用，取培養(yǎng)的菌絲體，過濾，將濾紙放入信封中，注明菌種名稱、日期、編號等，放入-80℃超低溫冰箱中進(jìn)行保藏。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌絲生長情況

在分離培養(yǎng)基上，菌絲從組織塊邊緣萌發(fā)長出，生長較好，但不向周圍的培養(yǎng)基中蔓延，老化的程度較快，老化過程中菌絲減少，最后變?yōu)楣腆w塊狀物，并且分泌褐色水珠。菌絲生長情況見表1，菌絲圖片見圖2。

由圖2可知，白牛肝菌和黃牛肝菌在2種培養(yǎng)基上菌絲的萌發(fā)速度和生長情況差別不是很大，菌絲也生長較好，但菌絲在培養(yǎng)基②上生長比培養(yǎng)基①的老化速度要快，因此，培養(yǎng)基①可以作為2種牛肝菌分離的培養(yǎng)基。菌絲從組織塊上長出后生長較好，菌絲不向組織塊周圍的培養(yǎng)基中生長，難以挑取菌絲，因此，培養(yǎng)基①并非牛肝菌分離的最佳培養(yǎng)基。

表1 2種牛肝菌菌絲在不同培養(yǎng)基中生長情況

圖2 2種牛肝菌菌絲情況

2.2 液體培養(yǎng)

菌絲在液體培養(yǎng)基中生長緩慢，40 d后進(jìn)行觀察。菌絲在培養(yǎng)基③、培養(yǎng)基④培養(yǎng)基搖瓶中污染的幾率較大。培養(yǎng)基③搖瓶內(nèi)長出菌絲體，小而少。培養(yǎng)基④搖瓶中接種的菌絲幾乎不生長。

2.3 菌絲鑒定

以ITS1和ITS4為引物，2種牛肝菌菌絲進(jìn)行PCR擴(kuò)增所得rDNA-ITS區(qū)段大小均約為700 bp,BLAST比對結(jié)果可知，2種牛肝菌的rDNA-ITS序列（圖3）與Boletus edulis具有100%的相似性，從而確定2種牛肝菌與Boletus edulis是同一個種，具體分類地位如下：真菌界（Mycota）、擔(dān)子菌亞門（Basidiomycotina）、層菌綱（Hymenomycetes）、 傘菌目（Agaricales）、 牛肝菌科 （Boletaceae）、牛肝菌屬 （Boletus）、美味牛肝菌 （Boletus edulis Bull.:Fr）。

圖3 2種牛肝菌質(zhì)粒轉(zhuǎn)換后凝膠電泳成像

3 討論

菌絲分離成功較少，原因可能是牛肝菌菌絲從組織塊邊緣萌發(fā)長出，與組織塊有密切關(guān)系，菌絲不易挑取，挑取成功的菌絲接入新的培養(yǎng)基中難以生長。這與王海坤、李濤等[5]報道的一致。因此，美味牛肝菌的分離、培養(yǎng)所需要的營養(yǎng)因子和培養(yǎng)條件有待繼續(xù)研究。

組織分離法難以分離得到純的牛肝菌菌絲，可以采用其他分離方法進(jìn)行菌絲的分離，如孢子分離法。

菌種在-80℃超低溫冰箱中保存的時間比較長，保存后菌種的復(fù)壯及復(fù)壯后菌絲的生長情況需進(jìn)一步進(jìn)行研究。

菌種培養(yǎng)好之后，將繼續(xù)進(jìn)行菌根合成試驗(yàn)的研究。

[1]鄧百萬，陳文強(qiáng).美味牛肝菌母種培養(yǎng)基的篩選[J].福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2004，33(3)：396-399.

[2]陳文強(qiáng)，鄧百萬.美味牛肝菌深層發(fā)酵的研究[J].四川大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2005，42(2)：368-372.

[3]劉瓊波，蘇開美，白永順，等.美味牛肝菌的菌種分離培養(yǎng)試驗(yàn)初探[J].食用菌，2007(4)：25-26.

[4]陳劍山，鄭服叢.ITS序列分析在真菌分類鑒定中的應(yīng)用 [J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35(13)：3785-3786，3792.

[5]王海坤，李濤，趙丹丹，等.兩株滇產(chǎn)廣義美味牛肝菌的分離培養(yǎng)及其分子鑒定[J].云南植物研究，2007，29(5)：559-562.