紅菇子實(shí)體多糖的提取及其抗氧化活性研究

李碧嬋 ，李 淼，王賀祥*

（1.武夷學(xué)院茶學(xué)與生物系，福建 武夷山 354300；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193）

多糖又稱多聚糖（Polysaccharide），是由醛糖或酮糖通過脫水形成糖苷鍵，并以糖苷鍵線性或分枝連接而成的鏈狀聚合物。一般聚合度大于10，分子量為數(shù)萬至數(shù)百萬[1]。多糖是構(gòu)成生命活動的四大基本物質(zhì)之一，廣泛存在于生物體中，與生命的多種生理功能密切相關(guān)，具有重要的保健和臨床應(yīng)用價(jià)值。目前已有不少關(guān)于食用菌如豬苓、香菇、靈芝、云芝等多糖的研究。

紅菇（Russula）是一類大型菌根真菌，屬擔(dān)子菌門、擔(dān)子菌綱、紅菇目、紅菇科、紅菇屬[2]。紅菇中含有豐富的碳水化合物、蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素以及人體必需的微量元素，具有極高的營養(yǎng)保健價(jià)值。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，紅菇有抗癌、降血糖、降血脂、提高機(jī)體免疫力、抑菌、清除自由基、修復(fù)甲醛所致的氧化損傷等功效[3-10]。閩北是正紅菇（Russula vinosa Lindlad）的著名產(chǎn)區(qū)[11]。本文對閩北正紅菇中的主要活性物質(zhì)紅菇多糖的提取方法和體外抗氧化活性進(jìn)行了研究，為進(jìn)一步開發(fā)利用閩北紅菇提供了理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 材料

正紅菇子實(shí)體，購自武夷山。

1.2 試劑

DEAE-cellulose購自美國Sigma公司；蒽酮、乙酸乙酯、蔗糖、鐵氰化鉀、鄰二氮菲、硫酸亞鐵、過氧化氫、亞硝酸鈉、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺、乙醇等試劑均為分析純（AR）；水為重蒸水。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 紅菇多糖的提取

紅菇子實(shí)體流水沖洗去泥沙，60℃烘干至恒重，粉碎；然后稱取一定量菇粉于錐形瓶中，加水浸提，重復(fù)2次，減壓過濾后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮；再加入3倍體積乙醇，封口，靜置過夜，離心分離，沉淀物經(jīng)真空干燥即為粗多糖。

2.2 紅菇多糖的純化

將粗多糖溶于水，Sevage法除去蛋白質(zhì)，再乙醇沉淀，沉淀物抽濾干燥，依次用丙酮、乙醚洗滌，真空干燥得到紅菇多糖半純品。將該多糖溶于水，抽濾，濾液上DEAE-纖維素層析柱（2.5 cm×20 cm），用 0～1.0 mol·L-1NaCl緩沖液梯度洗脫，測定各管洗脫液在波長280 nm的吸光度，合并各分段洗脫液。

2.3 多糖含量及得率的測定

多糖含量測定：采用蒽酮-硫酸法測定，多糖得率（%）為粗多糖重量與子實(shí)體干粉重量的百分比值。

2.4 紅菇多糖還原力的測定

用Oyaizu等提出的還原三價(jià)鐵離子法測定正紅菇多糖的還原能力[12]。具體步驟如下：取pH 6.6的磷酸緩沖液和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的鐵氰化鉀溶液各2.0 mL，分別加入不同質(zhì)量濃度的多糖溶液2.0 mL，混勻后50℃水浴20 min，速冷，然后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的三氯乙酸溶液2 mL，混勻，3000 r·min-1離心10 min，取上清液2.0 mL，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%的氯化鐵0.4 mL，混勻，然后加入2.0 mL蒸餾水，混勻，以蒸餾水調(diào)零，在波長700 nm處測定吸光度。以抗壞血酸作為陽性對照，平行測定3次。

2.5 紅菇多糖清除·OH能力的測定

用Fenton反應(yīng)法產(chǎn)生羥基自由基（·OH），H2O2/Fe2+體系可以通過Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥基自由基（·OH），其反應(yīng)式如下：

H2O2+Fe2+→·OH+OH－+Fe3+

溶液中的鄰二氮菲-Fe2+水溶液（紅色）氧化為鄰二氮菲-Fe3+（褪色），以此測定·OH數(shù)量的變化，實(shí)現(xiàn)抗氧化劑清除自由基能力的測定[13]。

精密量取pH7.4 PBS緩沖液2.0 mL和8.0 mL重蒸水，混勻做空白參比管。

依次精密量取鄰二氮菲溶液（5 mmol·L-1）1.0 mL，PBS緩沖液2.0 mL， 硫酸亞鐵溶液（7.5 mmol·L-1）1.5 mL和重蒸水5.5 mL，混勻做未損傷管；依次精密量取鄰二氮菲溶液（5 mmol·L-1） 1.0 mL，PBS緩沖液 2.0 mL，硫酸亞鐵溶液（7.5 mmol·L-1） 1.5 mL，H2O2（0.1%） 1.0 mL 和重蒸水4.5 mL，混勻做損傷管。

依次精密量取鄰二氮菲溶液（5 mmol·L-1）1.0 mL，PBS緩沖液 2.0 mL， 硫酸亞鐵溶液（7.5 mmol·L-1）1.5 mL，H2O2（0.1%）1.0 mL，分別加入不同濃度的多糖溶液和重蒸水共4.5 mL，混勻做樣品管，以抗壞血酸作為標(biāo)準(zhǔn)抗氧化劑，將上述試管同時(shí)置于37℃恒溫水浴中，60 min，以空白參比管調(diào)零，在536 nm處測定吸光度，計(jì)算羥自由基清除率（d）。平行測定3次。式中：A1為加樣管在536 nm處吸光度；A2為損傷管在536 nm處吸光度；A3為未損傷管在536 nm處吸光度。

2.6 紅菇多糖在體外模擬胃液條件下清除NO2－的反應(yīng)

準(zhǔn)確量取不同濃度多糖溶液5.0 mL于25 mL的比色管中，加入pH為3.0的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液5.0 mL，5 mg·L-1NaNO2溶液2.0 mL，于37℃恒溫水浴鍋中恒溫反應(yīng)1 h，加入0.4%對氨基苯磺酸2.0 mL，搖勻靜置5 min，再加入0.2%鹽酸萘乙二胺1.0 mL，用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻靜置15 min。在540 nm處測其吸光度。以抗壞血酸為對照。清除率計(jì)算公式如下：

式中：E為清除率；A0為未加多糖時(shí)測定的NaNO2的吸光度；A為加多糖時(shí)測定的NaNO2的吸光度。

3 結(jié)果與分析

3.1 提取紅菇多糖的正交實(shí)驗(yàn)

選取水料比、浸提時(shí)間、浸提溫度3個對多糖提取影響較大的因素，按L9（34）設(shè)計(jì)三因素三水平試驗(yàn) （表1）。試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表1 試驗(yàn)因子和水平表L9(34)

表2 紅菇多糖提取正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

由表2中極差分析結(jié)果可知，各因素對紅菇多糖得率影響的主次順序?yàn)椋篈>C>B，即水料比對多糖得率的影響最大，浸提時(shí)間比水料比的影響稍小，浸提溫度的影響最小。各極差結(jié)果有A因素列為K3>K2>Kl，B因素列為K1>K3>K2，C因素列為K3>K2>Kl。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析得出較優(yōu)方案為：A3B1C3，即水料比為30，浸提溫度60℃，浸提時(shí)間3 h。在此提取條件下，多糖得率為4.326%。從水料比因素中最好的水平是A3，溫度最好的水平是B1，浸提時(shí)間最好的水平是C3，這三個水平組合起來即A3B1C3，這正好是實(shí)驗(yàn)號7的實(shí)驗(yàn)條件，所以可以確定A3B1C3是最優(yōu)方案。在這個條件下做驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果是多糖得率為4.335%，因此取平均值紅菇多糖得率為4.33%。

3.2 粗多糖的糖含量分析

以蒽酮-硫酸法測定，得到糖濃度含量x（g）與吸光度y之間的線性方程 y=0.0065x+0.0014，相關(guān)系數(shù)R2=0.9994，由此計(jì)算出粗多糖的糖含量為（45.83±0.54）%。

3.3 紅菇多糖的純化

粗多糖經(jīng)Sevage法去蛋白、DEAE-纖維素陰離子交換柱層析，分段洗脫后得到4個吸收峰D1、D2、D3和D4，經(jīng)蒽酮-硫酸法檢測均為多糖。其中D1組分多糖含量最高，其次為D4、D3，D2組分多糖含量最少。洗脫曲線如圖1所示。

3.4 紅菇多糖還原力的測定

紅菇多糖的還原力測定結(jié)果見表3和表4。

表3 紅菇粗多糖的還原力測定

從表3測定結(jié)果可以看出，紅菇多糖具有一定的還原力，且隨著劑量的增加，還原力逐漸增強(qiáng)。但與Vc相比，其還原力較弱，紅菇多糖劑量為125 μg·mL-1時(shí)的還原能力才與 3.75 μg·mL-1的 Vc 相當(dāng)（p＞0.05）。

由表4可知，不同劑量的紅菇多糖組分具有一定的還原力，且隨著紅菇多糖組分劑量的增加，其還原力逐漸增強(qiáng)。在相同劑量下，不同紅菇多糖組分的還原力大小依次為D4、D3、D2、D1。其中D1組分還原力較紅菇粗多糖弱。D4、D3、D2組分的還原力優(yōu)于紅菇粗多糖，在劑量為12.5 μg·mL-1時(shí)，超過粗多糖 75 μg·mL-1時(shí)的還原力。 但與 Vc相比，其還原力較弱。D4、D3、D2、D1組分的還原力分別為同劑量Vc的27.62%、17.62%、12.38%、1.35%。

3.5 紅菇多糖清除羥基自由基（·OH）的能力測定

紅菇多糖清除·OH試驗(yàn)結(jié)果見表5、表6。

表4 紅菇多糖不同組分還原力測定

表5 紅菇粗多糖對·OH的清除效果

表6 紅菇多糖不同組分對·OH的清除效果

從表5可以看出，紅菇多糖和Vc對·OH均有清除作用，在 50 μg·mL-1～800 μg·mL-1之間隨著劑量增加，清除率明顯上升，特別是劑量從 400 μg·mL-1增到 600 μg·mL-1時(shí)，清除率從22.95%躍升到65.32%；此后隨著劑量的增加，清除率緩慢上升，當(dāng)劑量增加到800 μg·mL-1時(shí)，清除率達(dá)到最大，為77.66%。而Vc溶液在該劑量范圍內(nèi)清除率在4.97%～72.06%之間，也隨著劑量增加而增加。

當(dāng)紅菇多糖劑量增加到 600 μg·mL-1和 800 μg·mL-1時(shí)，清除率優(yōu)于 Vc（p＜0.01），劑量增加到 1000 μg·mL-1時(shí)清除率與同劑量Vc相當(dāng)，無顯著差異（p＞0.05），說明紅菇多糖對·OH具有良好的清除作用。

不同紅菇多糖組分對·OH的清除效果如表6所示，不同劑量的紅菇多糖組分對芬頓體系產(chǎn)生的·OH自由基均有一定的清除作用，且隨著紅菇多糖組分劑量的增加，其清除效果逐漸增強(qiáng)。 在劑量為 25 μg·mL-1時(shí)，D1、 D2、 D3、D4對·OH的清除率分別是 4.63%、39.80%、28.51%和53.13%，以D4對·OH的清除效果最佳。在低劑量時(shí)，純化后的多糖對·OH的清除效果優(yōu)于粗多糖及Vc。其中D1組分在劑量為100 μg·mL-1時(shí)對·OH的清除率分別是同劑量粗多糖的3.78倍，Vc的1.71倍；而D2、D3、D4組分在使用劑量為25 μg·mL-1時(shí)，對·OH的清除率均超過粗多糖 400 μg·mL-1時(shí)的清除率； 在該使用劑量下，D2、 D3組分對·OH的清除率超過 Vc為 200 μg·mL-1時(shí)的清除率（20.44%），D4組分對·OH的清除率超過 50%，超過 Vc 400 μg·mL-1時(shí)的清除率（48.45%）。 由此可知 D4具有很強(qiáng)的清除·OH的活性。

3.6 紅菇多糖在體外模擬胃液的NO2－清除反應(yīng)

亞硝酸鹽（NO2－）是亞硝胺的前體物，亞硝胺是人和動物的強(qiáng)致癌物，它能引起人體和動物的肝臟等多種器官的惡性腫瘤。通過消除體內(nèi)的NO2－，可以明顯減少患癌的比率[14]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表7所示。

表7 紅菇粗多糖在體外模擬胃液條件下對NO2-的清除效果

由表7測定結(jié)果可見，紅菇粗多糖和Vc均能有效清除NO2－，且隨著劑量的增加，清除率呈現(xiàn)出明顯的梯度變化。 紅菇多糖劑量從 125 μg·mL-1增至 375 μg·mL-1時(shí)，清除率顯著增加，當(dāng)用量達(dá)到375 μg·mL-1時(shí),清除率達(dá)到最大45.3%，再增加多糖的劑量時(shí)，清除率反而下降。而Vc劑量為125 μg·mL-1時(shí)，清除率即超過 50%，能顯著清除NO2－，且隨著Vc劑量增加，清除率增大；Vc的清除率顯著高于同劑量的紅菇粗多糖（p＜0.01）。

不同紅菇多糖組分在體外模擬胃液條件下對NO2－的清除效果不同，D4組分在體外模擬胃液條件下對NO2－有一定的清除作用，且隨著多糖劑量的增加，清除率呈現(xiàn)出明顯的梯度變化；在劑量為100 μg·mL-1時(shí)，D4組分對NO2－的清除率超過粗多糖在125 μg·mL-1時(shí)的清除率。但較Vc弱。其余各組分對NO2－均無清除作用。

4 討論

許多研究表明食用菌類的多糖對ROS具有清除作用，能減少脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的生成量，增加超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶 (GSH-Px)活性，具有良好的抗氧化性能，且毒副作用小，是具有清除自由基和代謝調(diào)節(jié)作用的天然物質(zhì)。從正紅菇子實(shí)體中提取得到紅菇粗多糖，經(jīng)脫蛋白、DEAE-纖維素陰離子交換柱層析分離得到 D1、 D2、 D3和 D4四個組分。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，紅菇粗多糖及其各組分具有一定的還原能力，對芬頓體系產(chǎn)生的·OH有較好的清除作用，在體外模擬胃液條件下對NO2－有一定的清除效果，說明紅菇多糖具有一定的抗氧化作用。與Vc相比，紅菇多糖在還原能力和清除NO2－的能力要弱很多，而在清除·OH方面卻顯示了極強(qiáng)的能力。尤其是D4組分，在極低的濃度下（25 g·mL-1）對·OH的清除率超過50%，超過Vc濃度400 μg·mL-1時(shí)的清除率（48.45%）。

上述實(shí)驗(yàn)表明，紅菇多糖的開發(fā)利用為真菌多糖提供了新的材料和數(shù)據(jù)，為篩選抗氧化藥物提供了理論依據(jù)，并可為紅菇的進(jìn)一步研究和開發(fā)利用提供依據(jù)。

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