傅武勝等

摘要：建立了食品中脂肪酸單氯丙醇單酯與雙酯含量的測定方法。稱取0.1 g的油脂樣品，加入內(nèi)標(biāo)后，轉(zhuǎn)入氨基固相萃取柱，先以6.0 mL正己烷洗脫脂肪酸單氯丙醇雙酯（MCPD雙酯），再以6.0 mL正己烷-乙酸乙酯混合溶劑洗脫脂肪酸單氯丙醇單酯（MCPD單酯），分別收集洗脫液并濃縮至近干，殘余物經(jīng)甲醇鈉水解和苯基硼酸（PBA）衍生后，供氣相色譜/質(zhì)譜（GCMS）分析。MCPD單酯、MCPD雙酯的檢出限在83～142 μg/kg（均以MCPD計(jì)）之間，線性范圍為25～500 μg/L（R2>0.9990）。以花生油和嬰幼兒奶粉脂肪提取物為基質(zhì)，在250～1000 μg/kg范圍內(nèi)進(jìn)行3種濃度水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，MCPD單酯與雙酯的回收率在86.5%～104.0%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.4%～13.2%（n=6）。此外，本方法成功應(yīng)用于市售食用植物油和嬰幼兒奶粉中MCPD單、雙酯的污染調(diào)查。

關(guān)鍵詞：脂肪酸； 3氯1，2丙二醇單酯； 3氯1，2丙二醇雙酯； 2氯1，3丙二醇單酯； 2氯1，3丙二醇雙酯； 食用植物油； 奶粉； 氣相色譜質(zhì)譜法； 固相萃取法

1引言

氯丙醇與脂肪酸酯化形成的脂肪酸氯丙醇酯（氯丙酯）是近年來國際上新出現(xiàn)的食品安全問題，尤其是脂肪酸3氯1，2丙二醇酯（簡稱3MCPD酯）的污染最為突出。氯丙醇是公認(rèn)的食品加工中形成的污染物，3氯1，2丙二醇（3MCPD）具有腎臟毒性、生殖毒性、免疫抑制作用和潛在致癌性而被廣泛關(guān)注[1，2]。早在1980年就發(fā)現(xiàn)植物蛋白在酸水解中會(huì)形成3MCPD酯[3，4]，隨后在奶粉[5]、山羊奶[6]、食用油[7]以及油炸食品[8]中也檢出該成分。氯丙酯尤其在食用油和奶粉等脂肪含量較高的食品中污染水平較高，食物中氯丙酯的含量是氯丙醇的5～396倍[9～13]，因此氯丙酯問題引起了歐盟等食品安全機(jī)構(gòu)的極大關(guān)注。目前， 氯丙酯的毒性仍不清楚，對其健康風(fēng)險(xiǎn)的擔(dān)心主要是因?yàn)槁缺サ乃猱a(chǎn)物氯丙醇的毒性作用[14～17]。3MCPD酯在腸道水解后將增加人體3MCPD的暴露水平，3MCPD攝入量是其暫定每日最大耐受量（TDI）（2 μg/kg·bw）的5～100倍[18，19]。由于3MCPD具有1～2個(gè)羥基，因此3MCPD酯具有3MCPD單酯和雙酯兩種形式，結(jié)構(gòu)上的差異可能導(dǎo)致毒理學(xué)作用的差異。實(shí)驗(yàn)表明，3MCPD雙酯會(huì)致大鼠精子減少（生殖毒性），3MCPD單酯不僅具有生殖毒性，還可能造成大鼠腎小管壞死（腎臟毒性）[16]。在模擬腸道的脂肪酶水解試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，3MCPD單酯水解生成3MCPD的速率遠(yuǎn)超過3MCPD雙酯[20，21]。因此，有必要對3MCPD單/雙酯進(jìn)行分離和分別檢測，獲得食品中3MCPD單酯與雙酯含量的數(shù)據(jù)，以更準(zhǔn)確地評估3MCPD酯的健康風(fēng)險(xiǎn)。

國際上測定食品（油脂）中3MCPD酯總量的研究較多[22]，但對3MCPD單/雙酯含量分別檢測的研究極少。據(jù)報(bào)道采用氨丙基（Aminopropyl）[23]或硅膠[24]固相萃取法，以正己烷、乙醚、二氯甲烷、石油醚和乙酸乙酯混合溶劑洗脫，將3MCPD單酯與雙酯分離，進(jìn)一步水解、凈化、衍生后，用GCMS分別檢測。但該法所用溶劑種類多、比例復(fù)雜、體積多達(dá)850 mL、操作較為繁瑣，且未證實(shí)方法是否適合各類油脂中不同脂肪酸組成的氯丙醇單酯、雙酯。超臨界流體色譜三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜法也可用于測定3MCPD單酯/雙酯[25]， 該法測定步驟雖簡單，但對儀器要求較高，且容易污染。本研究采用氨基固相萃取法，利用正己烷-乙酸乙酯混合溶劑洗脫，并采用堿水解苯基硼酸（PBA）衍生GCMS法測定[26]；方法除了可測定3MCPD單酯/雙酯外，還可能適用于2氯1，3丙二醇（2MCPD）單酯/雙酯的測定。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

3800型氣相色譜儀和Saturn 2200離子阱型質(zhì)譜儀（美國Varian公司）；NEVAPTM 111型氮吹儀（美國Organomation Associates公司）；Microfuge型高速離心機(jī)（美國Beckman公司）；6 mL聚丙烯固相萃取柱柱筒（Angela公司）。玻璃器皿在220 ℃下烘烤3 h后使用。

2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

準(zhǔn)確移取適量標(biāo)準(zhǔn)及內(nèi)標(biāo)工作液，以正己烷稀釋成濃度分別為25， 50， 100， 200和500 μg/L的MCPD單酯、MCPD雙酯標(biāo)準(zhǔn)系列，內(nèi)標(biāo)濃度均為100 μg/L，再按文獻(xiàn)[21]方法水解、凈化、衍生處理，供GCMS分析。

2.5樣品中氯丙酯含量的測定

上樣： 稱取0.1 g食用油或油脂食品的脂肪于1.5 mL塑料離心管中，準(zhǔn)確加入混合內(nèi)標(biāo)工作液50 μL， 渦旋混勻后超聲5 min，轉(zhuǎn)入固相萃取柱（500 mg/6 mL，經(jīng)4.0 mL正己烷活化），并以0.2 mL正己烷洗滌離心管兩次，將洗滌液一并轉(zhuǎn)入固相萃取柱中。

洗脫：先以6 mL正己烷洗脫MCPD雙酯；再用正己烷/乙酸乙酯（7∶3， V/V）洗脫MCPD單酯，分別收集洗脫液，并將洗脫液置于氮?dú)饬飨戮従彎饪s至近干。

分別于上述分離得到的樣品中，超聲混勻，再按文獻(xiàn) [26]方法水解、凈化、衍生處理，得到1.0 mL待測溶液，供GCMS分析，以同位素內(nèi)標(biāo)法定量。

3結(jié)果與討論

3.1MCPD衍生物的鑒定以及定量離子的確定

3.3洗脫分離溶劑的比例

分別以10 mL不同比例的正己烷乙酸乙酯（9∶1， 8∶2， 7∶3， V/V）和正己烷作為洗脫劑，每種條件重復(fù)3次。對于MCPD雙酯，4種溶劑皆能將其洗脫下來，但以10 mL正己烷的洗脫效果最優(yōu)，回收率為83.1%～103.0%； 對于MCPD單酯，除10 mL正己烷外，其余3種比例的溶劑均能將其洗脫下來，并以正己烷乙酸乙酯（7∶3， V/V）洗脫效果最好，回收率在87.2%～97.8%之間。這可能由于MCPD單酯與雙酯結(jié)構(gòu)上有差異，導(dǎo)致兩者極性不同，含有一個(gè)羥基的MCPD單酯極性略強(qiáng)于MCPD雙酯。因此，采用正己烷作為MCPD雙酯的洗脫溶劑，正己烷乙酸乙酯（7∶3， V/V）作為MCPD單酯的洗脫溶劑。

3.4洗脫分離溶劑的體積

為進(jìn)一步確定所需的洗脫劑體積，分別以10 mL正己烷、正己烷/乙酸乙酯（7∶3， V/V）洗脫MCPD雙酯與MCPD單酯，每2 mL為一階段收集洗脫液。結(jié)果表明，無論是MCPD單酯還是MCPD雙酯，當(dāng)洗脫溶劑體積為4.0 mL時(shí)，其回收率較為理想（94.6%～99.3%）；增至6.0 mL時(shí)，結(jié)果與4.0 mL相差不大，說明4.0 mL溶劑足以洗脫大部分的MCPD單酯/雙酯。但考慮到實(shí)驗(yàn)條件可能存在的微小變化，如填料的松緊或者洗脫流速的差異等，甚至某些樣品MCPD單/雙酯含量異常高，因此洗脫溶劑體積均選擇6.0 mL。

3.5不同類型脂肪酸MCPD單/雙酯的分離驗(yàn)證

考慮到不同類型脂肪酸的碳數(shù)和單雙鍵數(shù)量、空間結(jié)構(gòu)等不同，由此可能導(dǎo)致其洗脫特性不同，需進(jìn)一步驗(yàn)證。以不同種類脂肪酸構(gòu)成的MCPD單酯、MCPD雙酯標(biāo)準(zhǔn)液（十二碳的飽和月桂酸、十六碳的飽和棕櫚酸、十八碳的不飽和亞麻酸、十八碳的飽和硬脂酸）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，6.0 mL正己烷可把上述各類脂肪酸的MCPD雙酯洗脫下來，回收率為92.3%～97.4%，但無法洗脫MCPD單酯，見圖2；但以6.0 mL正己烷酸乙酯（7∶3， V/V）混合液可將MCPD單酯洗脫下來，回收率為93.7%～99.4%，見圖2a；由此可見，優(yōu)化的方法適用于各類脂肪酸MCPD單酯與雙酯的分離。

3.6檢出限和定量限

在花生油基質(zhì)中加標(biāo)，獲得3MCPD單、雙酯和2MCPD雙酯的檢出限（LOD，S/N=3）分別為83， 125和100 μg/kg，定量限（LOQ，S/N=10）分別為278， 417和333 μg/kg。在嬰幼兒奶粉脂肪提取物基質(zhì)中，3MCPD單、雙酯以及2MCPD雙酯的檢出限略高，分別為95.1， 142和122 μg/kg， 脂肪定量限分別為316， 473和406 μg/kg，這說明即使在基質(zhì)較為復(fù)雜的嬰幼兒奶粉脂肪提取物中，方法的檢出限和定量限也滿足分析要求。

3.7線性范圍

3MCPD棕櫚酸單酯與雙酯以及2MCPD二硬脂酸酯含量分別以3MCPD和2MCPD計(jì)算。以3MCPD， 2MCPD與各自內(nèi)標(biāo)峰面積比值y和各自的質(zhì)量x（ng）計(jì)算線性回歸方程。結(jié)果表明，在25～500 ng范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.9990。

3.8準(zhǔn)確度和精密度

3.9實(shí)際樣品分析

利用本方法調(diào)查了12個(gè)品種的72份市售食用植物油樣品和7個(gè)品牌31份嬰幼兒配方奶粉中MCPD單/雙酯的含量，同時(shí)按文獻(xiàn) [26] 方法測定脂肪酸MCPD酯總量。結(jié)果表明，脂肪中以MCPD雙酯含量為主體，MCPD單酯含量占MCPD酯總量的5.0%～45.0%。此外，利用本方法測定的MCPD單酯、雙酯含量之和占用文獻(xiàn)[21]方法測定MCPD酯總量的71.9%～98.2%，驗(yàn)證了本方法的可靠性。

本方法操作較為簡便、靈敏度較高、結(jié)合內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量，結(jié)果準(zhǔn)確可靠， 適用于檢測食用植物油和嬰幼兒奶粉中MCPD單酯、雙酯含量的檢測方法。

References

1JECFA， Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives， Meeting （67th： 2006： Rome， Italy） Evaluation of Certain Food Additives and Contaminants： [Blumhorst， 2011 #42] Sixtyseventh report of the Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives， WHO Technical Report Series， 2007， 940： 45-48

2Lynch B S， Bryant D W， Hook G J， Earle R N， Munro I C. Int. J. Toxicol.， 1998， 17 （1）： 47-76

3Davidek J，Velíek J， Kubelka V. Lebensm. Unters. Forsch.， 1980， 171（1）： 14-17

4GardnerA M， Yurawecz M P， Cunningham W C. Bull. Environ. Contam. Toxicol.， 1983， 31（6）： 625-630

5Zelinkov Z， Doleal M， Velíek J. Eur. Food Res. Technol.， 2009， 228（4）： 571-578

6Hamlet C G，Asuncion L， Velíek J. Eur. J. Lipid Sci. Technol.， 2011， 113（3）： 279-303

7Matthus B， Pudel F， Fehling P. Eur. J. Lipid Sci. Technol.， 2011， 113（3）： 380-386

8Zelinkov Z， Doleal M， Velíek J. Czech J Food Sci.， 2009， 27（4）： 421-424

9Svejkovsk B ， Novotny O， Divinov V， Reblova Z， Dolezal M， Velíek J. Food Sci.， 2004， 22（2）： 190-196

10Doleal M ， Chaloupsk M ， Divinov V ， Svejkovsk B， Velíek J. Eur. Food Res. Technol.， 2005， 221（3）： 221-225

11Zelinkov Z， Svejkovsk B ， Velíek J . Food Addit. Contam.， 2006， 23（12）： 1290-1298

12Divinov V， Doleal M ， Velíek J . Czech. J. Food Sci.， 2007， 25（1）： 39-47

13K Karsulinov L， FolprechtovB ， Doleal M ， DostlovJ ， Velíek J. Food Sci.， 2007， 25（5）： 257-264

14Myher J J ， Kuksis A ， Marai L ，Cerbulis J. Lipids.， 1986， 21（5）： 309-314

15Hamlet C G， Sadd P A， Gray D A. J. Agric. Food Chem.， 2004， 52（7）： 2059-2066

16European Commission， European Commission Regulation No. 466/2001. Off. J. Eur. Commun.， 2001， March 16， L77：1-13

17Weisshaar R. Eur. J. Lipid. Sci. Technol.， 2011， 113（3）： 304-308

19Liu M ， Gao B Y ， Qin F， Qin F， Shi H M， Luo W. Foods. Chem. Toxicol.， 2012， 50（10）： 3785-3791

20Seefelder W， Varga N ， Studer A. Food Addit . Contam. Part A， 2008， 25（4）： 391-400

21Buhrke T ， WeiXhaar R ， Lampen A. Arch. Toxicol， 2011， 85（10）： 1201-1208

22YAN XiaoBo， WU ShaoMing， LI Nan， LV HuaDong， FU WuSheng. Chinse Journal of Chromatography， 2013， 31（2）： 95-101

23Janis C ， Owen W P ， Ray H L ， Edwin G P， Harold M. J. Agric. Food Chem.， 1984， 32（3）： 474-476

24Zuzana Z， Doleqal M， Jan V. Eur. Food Res. Technol .， 2009， 228（4）： 571-578

25Hori K， Matsubara A， Uchikata T. J. Chromatogr. A， 2012， 1250： 99-104

26 FU WuSheng， YAN XiaoBo， L HuaDong， LI Nan， WU ShaoMing. Chinese J. Anal. Chem.， 2012， 40（9）： 1329-1335

27GB5413.32010， Determination of Fat in Infant Foods and Milk Products. National Standards of Food Safety

11Zelinkov Z， Svejkovsk B ， Velíek J . Food Addit. Contam.， 2006， 23（12）： 1290-1298

12Divinov V， Doleal M ， Velíek J . Czech. J. Food Sci.， 2007， 25（1）： 39-47

13K Karsulinov L， FolprechtovB ， Doleal M ， DostlovJ ， Velíek J. Food Sci.， 2007， 25（5）： 257-264

14Myher J J ， Kuksis A ， Marai L ，Cerbulis J. Lipids.， 1986， 21（5）： 309-314

15Hamlet C G， Sadd P A， Gray D A. J. Agric. Food Chem.， 2004， 52（7）： 2059-2066

16European Commission， European Commission Regulation No. 466/2001. Off. J. Eur. Commun.， 2001， March 16， L77：1-13

17Weisshaar R. Eur. J. Lipid. Sci. Technol.， 2011， 113（3）： 304-308

19Liu M ， Gao B Y ， Qin F， Qin F， Shi H M， Luo W. Foods. Chem. Toxicol.， 2012， 50（10）： 3785-3791

20Seefelder W， Varga N ， Studer A. Food Addit . Contam. Part A， 2008， 25（4）： 391-400

21Buhrke T ， WeiXhaar R ， Lampen A. Arch. Toxicol， 2011， 85（10）： 1201-1208

22YAN XiaoBo， WU ShaoMing， LI Nan， LV HuaDong， FU WuSheng. Chinse Journal of Chromatography， 2013， 31（2）： 95-101

23Janis C ， Owen W P ， Ray H L ， Edwin G P， Harold M. J. Agric. Food Chem.， 1984， 32（3）： 474-476

24Zuzana Z， Doleqal M， Jan V. Eur. Food Res. Technol .， 2009， 228（4）： 571-578

25Hori K， Matsubara A， Uchikata T. J. Chromatogr. A， 2012， 1250： 99-104

26 FU WuSheng， YAN XiaoBo， L HuaDong， LI Nan， WU ShaoMing. Chinese J. Anal. Chem.， 2012， 40（9）： 1329-1335

27GB5413.32010， Determination of Fat in Infant Foods and Milk Products. National Standards of Food Safety

11Zelinkov Z， Svejkovsk B ， Velíek J . Food Addit. Contam.， 2006， 23（12）： 1290-1298

12Divinov V， Doleal M ， Velíek J . Czech. J. Food Sci.， 2007， 25（1）： 39-47

13K Karsulinov L， FolprechtovB ， Doleal M ， DostlovJ ， Velíek J. Food Sci.， 2007， 25（5）： 257-264

14Myher J J ， Kuksis A ， Marai L ，Cerbulis J. Lipids.， 1986， 21（5）： 309-314

15Hamlet C G， Sadd P A， Gray D A. J. Agric. Food Chem.， 2004， 52（7）： 2059-2066

16European Commission， European Commission Regulation No. 466/2001. Off. J. Eur. Commun.， 2001， March 16， L77：1-13

17Weisshaar R. Eur. J. Lipid. Sci. Technol.， 2011， 113（3）： 304-308

19Liu M ， Gao B Y ， Qin F， Qin F， Shi H M， Luo W. Foods. Chem. Toxicol.， 2012， 50（10）： 3785-3791

20Seefelder W， Varga N ， Studer A. Food Addit . Contam. Part A， 2008， 25（4）： 391-400

21Buhrke T ， WeiXhaar R ， Lampen A. Arch. Toxicol， 2011， 85（10）： 1201-1208

22YAN XiaoBo， WU ShaoMing， LI Nan， LV HuaDong， FU WuSheng. Chinse Journal of Chromatography， 2013， 31（2）： 95-101

23Janis C ， Owen W P ， Ray H L ， Edwin G P， Harold M. J. Agric. Food Chem.， 1984， 32（3）： 474-476

24Zuzana Z， Doleqal M， Jan V. Eur. Food Res. Technol .， 2009， 228（4）： 571-578

25Hori K， Matsubara A， Uchikata T. J. Chromatogr. A， 2012， 1250： 99-104

26 FU WuSheng， YAN XiaoBo， L HuaDong， LI Nan， WU ShaoMing. Chinese J. Anal. Chem.， 2012， 40（9）： 1329-1335

27GB5413.32010， Determination of Fat in Infant Foods and Milk Products. National Standards of Food Safety