楊云松，高 鵬，代 龍

(山東中醫(yī)藥大學 藥學院，山東 濟南 250355)

糖苷類化合物體外生物轉(zhuǎn)化的研究進展

楊云松，高 鵬，代 龍

(山東中醫(yī)藥大學 藥學院，山東 濟南 250355)

糖苷類化合物的體外生物轉(zhuǎn)化可為發(fā)掘藥物體內(nèi)起效的物質(zhì)基礎提供依據(jù)，同時能極大提高藥物的生物利用度。本文對黃酮苷、皂苷、環(huán)烯醚萜苷的體外生物轉(zhuǎn)化進行了綜述。

苷;體外生物轉(zhuǎn)化;研究進展

糖苷，又稱配糖體，由弱極性的配基與強極性的糖基組成，因而糖苷類化合物分子具有極性大、脂溶性差、分子質(zhì)量大的特點，不易透過腸壁黏膜吸收。糖苷由于在腸內(nèi)滯留時間較長，部分糖苷在腸道內(nèi)特異菌群分泌的酶的作用下發(fā)生了轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物極性減小，脂溶性增加，更容易透過腸壁進入血液循環(huán)，進而發(fā)揮藥效［1］。腸道菌群的代謝轉(zhuǎn)化對苷類化合物的藥效發(fā)揮起到重要作用。體外生物轉(zhuǎn)化技術在轉(zhuǎn)化糖苷類化合物方面的應用，將有助于進一步明確苷類藥物口服起效的機制，同時對指導開發(fā)以苷元為藥效物質(zhì)基礎的高效制劑具有潛在的價值。

1 體外生物轉(zhuǎn)化概述

體外生物轉(zhuǎn)化也稱體外生物催化，是指利用植物離體培養(yǎng)細胞或器官、動物、微生物及其細胞器等對外源化合物進行結(jié)構(gòu)修飾而獲得有價值產(chǎn)物的生理生化反應，其本質(zhì)是利用生物體系本身所產(chǎn)生的酶在體外對外源化合物進行酶催化反應［2］。中藥苷類成分的體外生物轉(zhuǎn)化研究已有較多報道，本文就體外生物轉(zhuǎn)化技術在黃酮苷、皂苷、環(huán)烯醚萜苷轉(zhuǎn)化方面的應用作一綜述。

2 體外生物轉(zhuǎn)化糖苷化合物的應用

2．1 黃酮苷的轉(zhuǎn)化

生物轉(zhuǎn)化技術在銀杏黃酮苷、大豆異黃酮苷、淫羊藿苷、柚皮苷、黃芩苷、芒果苷等黃酮苷的轉(zhuǎn)化方面有廣泛的應用［3-4］。銀杏葉黃酮主要是以黃酮苷的形式存在，占黃酮提取物總含量的95%以上［5］，銀杏黃酮苷元的效價是黃酮葡糖苷效價的7倍［6］，因為大部分的銀杏黃酮在人體內(nèi)不能通過小腸壁進入到血液中，僅有小部分在結(jié)腸內(nèi)益生菌(如乳酸菌和雙歧桿菌)分泌的β-葡糖苷酶作用下，產(chǎn)生苷元再吸收進入血液，因此，通過改善黃酮的構(gòu)型、提高其在腸道中的吸收率是提高其生物利用度的重要途徑［7］。伍毅等［8］采用β-葡萄糖苷酶水解銀杏葉提取物的方法，使糖苷型黃酮轉(zhuǎn)化為苷元型黃酮，并通過正交試驗得出水解的最佳工藝參數(shù)，即溫度40 ℃，酶濃度 5×10－3mg/mL，pH 值5．0，水解 6 h。王建偉等［9］經(jīng)過研究酶法轉(zhuǎn)化銀杏葉中的黃酮苷，先經(jīng)過復合酶預處理后，再利用柚皮苷酶作為轉(zhuǎn)化酶繼續(xù)水解，可獲得高含量的苷元。

大豆異黃酮是大豆中的主要活性成分之一，具有很高的保健和藥用價值。近年來發(fā)現(xiàn)大豆中異黃酮的存在形式主要是結(jié)合型葡糖苷，但天然存在的異黃酮須在腸道中脫去糖基轉(zhuǎn)化成苷元后才能被機體吸收利用，進而發(fā)揮其生物學功能。因此酶水解對原料進行處理，既能增強大豆異黃酮的生物活性，又能提高其生物利用度，具有巨大的市場潛力和經(jīng)濟價值。毛跟年等［10］通過正交試驗優(yōu)化出β-葡萄糖苷酶水解大豆異黃酮的最佳水解條件:反應時間1．5 h、水解溫度40℃、溶液 pH值為4．5、底物濃度為10 mg/mL。王美玲等［11］從雞內(nèi)金中提取、分離純化得到β-葡糖苷酶，以大豆異黃酮做為水解底物，該酶對大豆異黃酮苷能進行有效水解，水解率高達99%。

淫羊藿主要成分為淫羊藿苷，有增強內(nèi)分泌、促進骨髓細胞DNA合成和骨細胞生長的作用。淫羊藿苷有3個糖基，研究表明低糖基淫羊藿苷和淫羊藿苷元活性均明顯高于淫羊藿苷。金鳳燮［12］利用曲霉菌產(chǎn)生的誘導酶水解淫羊藿苷可制得低糖基淫羊藿苷或淫羊藿苷元，且轉(zhuǎn)化率高。柚皮苷為二氫黃酮類化合物的糖苷，鄭美瑜等［13］研究橙皮苷酶和柚皮苷酶2種糖苷酶對柑橘中柚皮苷結(jié)構(gòu)中的糖苷鍵的酶解作用，為酶法改性柚皮苷、提高其生物利用度提供理論基礎。赫玉芳等［14］研究黃芩苷最佳自身酶解工藝為用1．2倍的醋酸溶液(pH為4)浸潤12 h，浸潤溫度為40℃。黃慧學等［15］研究離體人腸道菌群在體外對芒果苷代謝轉(zhuǎn)化的情況，在與人腸道菌群共同孵育12 h，代謝物經(jīng)質(zhì)譜分析等手段鑒定為芒果苷的苷元。

2．2 皂苷的轉(zhuǎn)化

通過體外生物轉(zhuǎn)化可以將原人參二醇類皂苷或者原人參三醇類皂苷轉(zhuǎn)化生成次生皂苷。人參皂苷C-K在天然的人參中并不存在，是二醇型人參皂苷在腸道內(nèi)的降解產(chǎn)物和最終吸收形式，可發(fā)揮多種生物學活性。糖苷酶在體外可將人參皂苷Rb1C-3位的兩個-Glc鍵和C-20位的一個-Glc鍵水解，得到稀有皂苷C-K。陳嬌嬌等［16］對Absidia sp．G8r菌產(chǎn)的人參皂苷糖苷酶進行了分離純化，利用該酶水解人參皂苷Rb1得到了稀有皂苷C-K，發(fā)現(xiàn)水解過程是分步進行的，酶先水解Rb1生成Rd，大約8 h，酶水解Rd生成F2，大約18 h，酶水解F2生成C-K。人參次生皂苷Rh1是存在于天然藥物人參中三醇類皂苷，較其前體Rg1具有更強的整體和體外抗腫瘤作用。孫斯宜等［17］研究 Arthrobacter sp．No．3 GS 0202細菌酶轉(zhuǎn)化三醇類人參皂苷Rg1生成Rh1的反應條件，優(yōu)化出酶的最佳反應條件為人參皂苷Rg1質(zhì)量濃度0．1 mg/mL，30℃下反應24 h。

薯蕷皂苷元(Diosgenin)是薯蕷類甾體皂苷的配基，是合成各種甾體激素和甾體避孕藥的重要原料，常用于治療風濕關節(jié)炎、心腦血管疾病等。隨著研究的不斷深入，已經(jīng)從微生物中篩選出了多種不同菌株，這些菌株能分泌轉(zhuǎn)化生成薯蕷皂苷元的酶［18-19］。王亞南等［20］從真菌菌株Aspergillus sp．3042和Aspergillus sp．848培養(yǎng)液中分離得到糖苷酶，并將該酶與黃姜薯蕷皂苷在適宜條件下進行水解反應得到薯蕷皂素，其轉(zhuǎn)化效率高達95%，且發(fā)現(xiàn)與細菌及真菌的直接發(fā)酵法相比，酶水解方法操作簡單，效果更好。Qian等［21］在豬肝臟中找到的一種含量很高且水解能力很強的β-葡萄糖苷酶，作用于穿山龍薯蕷皂苷，得到薯蕷皂苷酶解產(chǎn)物3-O-(β-D-吡喃葡萄糖基)-薯蕷皂苷元單體。

商陸經(jīng)分離得到的三萜皂苷元，實驗證明其祛痰作用明顯強于商陸皂苷。賴道萬［22］考察了木聚糖酶、土豆酶、商陸酶、黑曲酶、苦杏仁酶、蝸牛酶等對商陸皂苷甲的水解活性，結(jié)果表明，黑曲酶、苦杏仁酶、蝸牛酶均能使商陸皂苷甲中的葡萄糖基發(fā)生水解，得到次苷商陸皂苷乙，只有蝸牛酶能使皂苷甲中的糖側(cè)鏈完全水解，得到其皂苷元-商陸酸甲酯，不過轉(zhuǎn)化率不高。柴胡皂苷a的體內(nèi)代謝首先是在胃酸的作用下分子的烯丙醚裂解，轉(zhuǎn)化為b1和g的二烯皂苷，再經(jīng)腸道菌群的水解作用代謝為柴胡苷元。從人糞便中分離出菌株 Bifidobacterium Saiko-1，-2 和 E．sp．A-44 分別參與這兩個階段的代謝，對其中酶進行精制后鑒定為具有特異性的水解柴胡皂苷β-D-葡糖苷酸酶和水解次柴胡皂苷的β-D-巖藻糖苷酶［23-24］。何晨［25］利用甘草酸為碳源的篩選模型，從新疆野生甘草土壤中分離篩選得到具有水解甘草酸產(chǎn)生甘草次酸的菌株HC-12，并采用發(fā)酵法轉(zhuǎn)化得出:10%甘草煎出液，裝液量為40%，添加適當?shù)牡础⒔饘匐x子及少量吐溫80，在溫度為32℃，轉(zhuǎn)速為180 r/min的條件下發(fā)酵120 h，轉(zhuǎn)化率達到90%以上。

2．3 萜苷的轉(zhuǎn)化

生物轉(zhuǎn)化在中藥芍藥苷、京尼平苷、桃葉珊瑚苷、牛蒡子苷等單萜苷，穿心蓮內(nèi)酯苷二萜苷，虎杖蒽醌萜苷等萜苷向苷元轉(zhuǎn)化方面有廣泛的應用。研究結(jié)果表明，芍藥苷及其代謝產(chǎn)物是鎮(zhèn)痛和鎮(zhèn)靜有效成分，并且芍藥苷代謝產(chǎn)物作用強于芍藥苷，而芍藥苷的口服生物利用度僅為3% ～4%，美國休斯頓大學的研究人員的研究結(jié)果表明造成芍藥苷口服生物利用度低的主要原因是芍藥苷口服后在腸道細菌分泌的β-葡糖苷酶催化下轉(zhuǎn)化成了芍藥苷代謝產(chǎn)物。Hattori等［26］首先報道了芍藥苷在人腸內(nèi)菌體外培養(yǎng)液中轉(zhuǎn)化成芍藥苷代謝素-Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，芍藥苷代謝素-Ⅰ為主要產(chǎn)物。王曉玲［27］利用L．brevis AS 1．12轉(zhuǎn)化芍藥苷為芍藥苷代謝素-I的最優(yōu)條件:溫度為37℃、轉(zhuǎn)化時間為6 h、pH值為7．5、底物濃度為5 mg/mL。透膜吸收方面在Caco-2細胞上的轉(zhuǎn)運研究［28］亦發(fā)現(xiàn)芍藥苷的生物利用度是其苷元的1/40。

京尼平苷是從桅子果中提取的一種環(huán)烯醚萜苷，該物質(zhì)的利膽作用僅限于口服給藥，靜脈注射無效，其苷元為京尼平，如果注射京尼平則有利膽作用，揭示京尼平苷的利膽作用是通過腸道菌群水解產(chǎn)生的。鄭禮勝［29］通過β-葡糖苷酶水解的方法，利用來源于苦杏仁的β-葡糖苷酶較好的獲得了京尼平，并考察出較合適的工藝條件?；衾俚龋?0］利用高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌種制備游離細胞和固定化細胞，將京尼平苷轉(zhuǎn)化為京尼平，轉(zhuǎn)化率高達98%，通過條件優(yōu)化，得到了最優(yōu)轉(zhuǎn)化條件。

杜仲籽中主要環(huán)烯醚萜苷類成分桃葉珊瑚苷，具有保肝、利尿、免疫調(diào)節(jié)等藥理活性。研究表明，其生物活性大多是通過其苷元實現(xiàn)的。桃葉珊瑚苷元是極不穩(wěn)定的化合物，極易分解變化，李楊［31］比較了9種來源的β-葡糖苷酶對桃葉珊瑚苷的生物轉(zhuǎn)化能力，來源于苦杏仁的葡萄糖苷酶水解桃葉珊瑚苷的效力最高，采用苦杏仁酶與桃葉珊瑚苷在37℃溫孵后，直接用0℃的乙酸乙酯進行液液萃取，真空濃縮后獲得了純度為92．23%的桃葉珊瑚苷苷元。牛蒡子苷在消化道中(尤其是口服時)所表現(xiàn)出的活性，主要是牛蒡子苷在消化道中經(jīng)腸道菌的作用轉(zhuǎn)化為苷元的脫甲基化物，此脫甲基化物在肝臟中的兒茶酚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶(COMT)DE的作用下恢復為苷元，苷元被運送到各個器官而發(fā)揮作用。歐志敏等［32］采用黑曲霉CGMCC No．2594發(fā)酵產(chǎn)生的葡萄糖苷酶酶液水解牛蒡子苷制備牛蒡子苷元，得出最佳初始pH值為6．0、最佳溫度為30℃、搖床轉(zhuǎn)速為150 r/min時，36 h牛蒡子苷元的產(chǎn)率可以達到94．7%。研究中發(fā)現(xiàn)穿心蓮內(nèi)酯19-β-葡糖苷用纖維素酶水解可獲得苷元［33］。田天麗等［34］從中藥材虎杖中篩選到一株具有轉(zhuǎn)化虎杖苷能力的根霉T-34，利用該菌株產(chǎn)生的β-葡糖苷酶能將虎杖苷轉(zhuǎn)化為白藜蘆醇，代謝轉(zhuǎn)化后測得虎杖苷的轉(zhuǎn)化率達98%。

3 結(jié)語

目前國內(nèi)生物轉(zhuǎn)化技術已廣泛應用于食品工業(yè)，基于中藥苷類物質(zhì)在腸道內(nèi)代謝的原理，該技術在醫(yī)藥行業(yè)也有很好的應用前景。中藥含有的糖苷類種類豐富，經(jīng)過體外生物轉(zhuǎn)化，可大大提高藥物的生物利用度，生產(chǎn)上可節(jié)省大量的藥材資源，臨床上苷元應用于患者，特別是在病理狀態(tài)下腸道菌群失調(diào)的患者，服用后無需腸道微生物轉(zhuǎn)化可直接被機體吸收，與葡糖苷類藥物相比具有起效迅速，適用人群廣的優(yōu)點。因此，體外生物轉(zhuǎn)化糖苷類中藥在創(chuàng)新藥物研究與開發(fā)中具有良好前景。

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Research advances in external bioconversion of glycoside compounds

YANG Yun-song，GAO-Peng，DAI-Long
(Shandong University of Traditional Chinese Medicine，Jinan 250355，China)

R284

A

1005-1678(2012)06-0927-04

2012-03-22

楊云松，男，碩士研究生，研究方向:中藥制劑工藝及質(zhì)量標準研究;代 龍，男，通信作者，教授，研究方向:中藥新藥開發(fā)及新劑型研究，Tel:0531-82960689，E-mail:dailongdailong@263．net。