李紅枝，劉玉超，唐松山

(廣東藥學(xué)院 基礎(chǔ)學(xué)院 廣東省重點生物活性實驗室，廣東 廣州 510006)

作用于血液系統(tǒng)的蛇毒蛋白酶的研究進(jìn)展

李紅枝，劉玉超，唐松山＊

(廣東藥學(xué)院 基礎(chǔ)學(xué)院 廣東省重點生物活性實驗室，廣東 廣州 510006)

蛇毒是蛇毒腺分泌的天然毒液，含有多種蛋白質(zhì)、多肽、酶類和其它小分子物質(zhì)，它們參與蛇的捕食消化和防御功能。蛇毒中含有許多種影響血液系統(tǒng)功能的蛋白質(zhì)或酶，因其顯著的生物功能和藥用活性，受到廣泛關(guān)注。本文就對蛇毒中影響血液系統(tǒng)的絲氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶、磷脂酶A2、L-氨基酸氧化酶和5'-核苷酸酶等蛋白酶的最新研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

蛇毒;血液系統(tǒng);絲氨酸蛋白酶;金屬蛋白酶;磷脂酶A2;L-氨基酸氧化酶;5'-核苷酸酶

世界上大約有3 000種蛇，其中有600種是有毒的。這些毒蛇主要分布于四大家族:游蛇科(Colubridae)、眼鏡蛇科(Elapidae)、蝰蛇科(Viperidae)和穴蛇科(Atractaspididae)。蛇毒中含有酶類和非酶類兩種蛋白質(zhì)，這些蛋白可以引起凝血，出血以及次生效應(yīng)，例如低血容量性休克、器官損傷、誘導(dǎo)血栓形成或出血等。蛇毒中的蛋白酶、磷脂酶A2(snake venom phospholipase A2，sn-PLA2)、L-氨基酸氧化酶和 5'-核苷酸酶(5'-nucleotidases)都是影響血液凝固的酶類。蛇毒蛋白酶屬于絲氨酸蛋白酶家族或金屬蛋白酶家族，能夠從不同方面影響血液凝固和纖溶系統(tǒng)。本文對作用于血液系統(tǒng)的蛇毒蛋白酶的研究進(jìn)展做一綜述。

1 絲氨酸蛋白酶家族

蛇毒絲氨酸蛋白酶具有精氨酸酯酶活性和?；钚裕蛟谄浯呋课还灿薪z氨酸殘基而得名。這類酶的活性可以被絲氨酸蛋白酶抑制劑-二異丙基氟磷脂(DFP)或苯甲基磺酰氟(PMSF)抑制。蛇毒絲氨酸蛋白酶主要存在于蝰蛇科、眼鏡蛇科和游蛇科的蛇毒中［1］，它們在蛋白質(zhì)底物肽鏈的帶正電荷氨基酸殘基右側(cè)水解。蛇毒絲氨酸蛋白酶具有一個典型的包含催化三聯(lián)體His-Asp-Ser的胰蛋白酶折疊結(jié)構(gòu)，該胰蛋白酶折疊結(jié)構(gòu)有12個氨基酸殘基組成，其中10個氨基酸殘基由5對二硫鍵連接，剩余的2個半胱氨酸形成橋狀。蛇毒絲氨酸蛋白酶作用于凝血或纖溶系統(tǒng)的多個環(huán)節(jié)，干擾凝血自穩(wěn)機制，按其作用靶蛋白的不同，可分為蛇毒類凝血酶(Snake venom thrombin-like enzymes，SVTLE)、蛇毒纖溶酶、蛇毒凝血因子激活劑和蛇毒纖溶酶原激活劑(Snake venom plasminogen activators，sn-PA)等。

1．1 SVTLE

SVTLE與凝血酶的序列相似性超過33%，在體外都能使纖維蛋白原凝結(jié)［2］。有些SVTLE，如來自 Bothrops marajoensis蛇毒的TLBm酶，可以引起血小板凝結(jié)。凝血酶的抑制劑，如抗凝血酶-Ⅲ、肝素和水蛭素通常不會對SVTLE產(chǎn)生抑制作用。根據(jù)從纖維蛋白原中釋放血纖肽的不同，可以將SVTLE分為3種類型:FP-A類型(釋放A肽)、FP-B類型(釋放B肽)和FP-AB類型(釋放A和B肽)。大多數(shù)SVTLE釋放血纖肽A。FP-B類型的SVTLE釋放血纖肽B的速度要快得多，需要長時間保溫才能引起纖維蛋白原凝結(jié);FPAB類型的SVTLE水解纖維蛋白原的方式與凝血酶相同，它既可以釋放血纖肽A又可以釋放血纖肽B。近5年來得到的SVTLE都屬于FP-A類型，它們是BJ-48(來源于Bothrops jararacussu蛇毒)，Leucurobin(來源于 Bothrops leucurus蛇毒)和Agacutin(來源于尖吻蝮蛇蛇毒)。

SVTLE通常不會激活凝血因子Ⅱ和因子ⅩⅢ，所產(chǎn)生的纖維蛋白聚合物分子間以氫鍵頭尾連接，成水溶性［3］。一些SVTLE對纖原水解能力較弱，在血液中形成長時間纖維蛋白單體，一旦有傷口，在傷口處加速血液凝固，即止血作用，這類SVTLE被發(fā)展成臨床注射止血劑，如注射用蛇毒血凝酶(來自Bothrops jararaca和Bothrops atrox蛇毒)、邦停(來自東北白眉蝮蛇蛇毒)［4］和蘇靈(來自尖吻蝮蛇蛇毒)［5］;有些酶對纖原的水解能力極強，在短時間內(nèi)大量耗竭纖維蛋白原形成可溶性纖維蛋白，這些纖維蛋白的形成或者纖原的快速降低，激活了血液中的組織型纖溶酶原激活劑(t-PA)，后者激活纖溶酶原形成纖溶酶，水解纖維蛋白，出現(xiàn)抗凝溶栓效果，這類SVTLE被發(fā)展成臨床溶栓藥，如東菱克栓酶(來自Gloydius shedaoensis 和 Gloydius ussuriensis 蛇毒)［6］、降纖酶(來自白眉蝮蛇和尖吻蝮蛇蛇毒)［7］、安克洛酶(來自 Calloselasma rhodostoma 蛇毒)［8］和 Crotalase(來自 Crotalus adamanteus蛇毒)［9］?？扇苄岳w維蛋白對體內(nèi)的纖溶酶敏感，易降解為無活性的小肽，在血管內(nèi)可迅速的被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)及腎臟清除。這就是SVTLE用于治療出血或血栓類疾病的作用機理。

1．2 蛇毒纖溶酶

蛇毒纖溶酶作用于纖維蛋白原的α和β鏈。各種蛇毒纖溶酶對α和β鏈的專一性及裂解速度不一致，在最近的報道中，Harobin(來源于 Lapemis hardwicki i蛇毒)、BpSP-Ⅰ(來源于Bothrops pauloensis蛇毒)和 TLBm既作用于α鏈又作用β鏈。Harobin在延長作用時間的情況下，還可以水解纖維蛋白原的γ鏈。重組蛋白Albofibrase(來源于Trimeresurus albolabris蛇毒)和 Bhalternin(來源于 Bothrops alternatus蛇毒)只作用于α鏈。BJ-48只作用β鏈。許多蛇毒纖溶酶既可同時具有溶解纖維蛋白原和纖維蛋白的活性。

1．3 蛇毒凝血因子激活劑

蛇毒蛋白對不同凝血因子起特異性激活作用。蛇毒凝血酶原(凝血因子Ⅱ)激活劑有金屬蛋白酶類和絲氨酸蛋白酶類之分［10］。根據(jù)作用機理和輔助因子的需求的不同，可分為A、B、C和D等4類，其中A和B類屬于金屬蛋白酶類，C和D類屬于絲氨酸蛋白酶類，它們僅存在于澳大利亞眼鏡蛇(Australian elapids)蛇毒中。C類的活性需要Ca2+和帶負(fù)電荷的活性磷脂，而D類的活性需要鈣離子、磷脂和凝血因子Va。所有蛇毒凝血酶原激活劑都是裂解凝血酶原，將凝血酶原轉(zhuǎn)化為凝血酶。在結(jié)構(gòu)和功能方面，蛇毒凝血酶原激活劑與一些凝血因子相類似［11］，C類類似于凝血因子Va或Xa復(fù)合物，如Pseutarin C(來源于Pseudonaja textilis蛇毒)，其中一個催化亞基與凝血因子Xa結(jié)構(gòu)相似，另一個與凝血因子Va結(jié)構(gòu)相似。Pseutarin C的重組研究表明，蛇毒凝血因子Va結(jié)構(gòu)對C蛋白的裂解具有抑制作用［12］。D類在結(jié)構(gòu)和功能方面都與凝血因子Xa相類似，如來源于Tropidechis carinatus蛇毒的Trocarin D。

除了凝血因子Ⅱ激活劑外，還有凝血因子Ⅹ、Ⅶ和Ⅴ激活劑［13］。Ⅹ因子激活劑是一個分子質(zhì)量約59 kD的蛋白質(zhì)，由一條重鏈和一條輕鏈通過二硫鍵連接而成。迄今為止，只發(fā)現(xiàn)了極少的凝血因子Ⅹ激活劑，例如，在眼鏡王蛇和金環(huán)蛇的蛇毒中發(fā)現(xiàn)了Ⅹ因子激活劑，它們都是單鏈糖蛋白，分子質(zhì)量分別為62和70 kD，具有Ca2+依賴性。在無Ca2+存在時不能使血液凝固，在有Ca2+存在時能顯著縮短凝血時間。迄今為止，還沒有分離出單一蛇毒Ⅶ因子激活劑。凝血因子Ⅴ的3個內(nèi)源性活化位點分別為 Arg709、Arg1018和Arg1545，其中最關(guān)鍵的位點是Arg1545。來源于Vipera lebetina蛇毒的VLFVA和來源于Vipera russelli蛇毒的RVV-V就是通過裂解Arg1545對凝血因子Ⅴ進(jìn)行激活。這類蛇毒酶可作為實驗的工具酶，在科研工作中參與活化不同凝血因子。

1．4 sn-PA

sn-PA主要存在于蝰亞科和蝮亞科蛇毒中［14］。迄今為止，發(fā)現(xiàn)了3種sn-PA，它們是TSV-PA(來源于Trimeresurus stejnegeri蛇毒)、Haly-Pat(來源于Agkistrodon halys brevicaudus蛇毒)和LV-PA(來源于Lachesis muta muta蛇毒)。sn-PA的分子質(zhì)量在30～35 kD，活性位點由組氨酸、天冬氨酸和絲氨酸殘基組成，與人組織纖溶酶原激活劑(t-PA)只有21% ～23%的同源性，兩者在結(jié)構(gòu)上存在較大差異［15］:sn-PA有200～300氨基酸殘基和蛋白酶區(qū)結(jié)構(gòu)，而人t-PA有527氨基酸殘基組成，除具有蛋白酶區(qū)外，還有指形區(qū)、表皮生長因子區(qū)、Kring2區(qū)和KHRR區(qū)結(jié)構(gòu)域，后四個局部結(jié)構(gòu)域參與體內(nèi)構(gòu)件分子之間的相互作用。sn-PA具有的單一蛋白酶功能結(jié)構(gòu)，必將在溶栓藥物的研究中伴有重要的地位。

2 金屬蛋白酶家族

蛇毒金屬蛋白酶(Snake venom metalloproteases，SVMP)是以Zn2+為活性中心的金屬蛋白酶，主要分布在蝰蛇科和響尾蛇科等［16］。SVMP普遍具有引起出血、水腫和炎癥等生物學(xué)活性。Bjarnason和Fox等根據(jù)所含結(jié)構(gòu)域數(shù)和分子質(zhì)量大小，將SVMP分為PⅠ～Ⅳ4種類型［17］。這類蛋白酶主要用作出血和炎癥研究的陽性試劑，如溶血和出血毒試驗等。

2．1 PⅠ型 SVMP

PⅠ型SVMP分子質(zhì)量較低，它具有非出血或出血活性，可以降解纖維蛋白原，但不降解血纖維蛋白。出血性PⅠ型SVMP能降低血液中血纖維蛋白原的含量，在破壞基底膜引起出血后，降低血液凝固能力，增強出血效應(yīng)［18］。目前已從皖南尖吻蝮蛇蛇毒中分離出3種PⅠ型出血毒素:Acutolysin A、Acutolysin B和 Acutolysin C。

2．2 PⅡ型 SVMP

PⅡ型SVMP包含金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域和類去整合素或去整合素樣結(jié)構(gòu)域，它通過金屬蛋白酶的水解作用產(chǎn)生了去整合素蛋白［19］。去整合素是從蛇毒中分離出來的一類小肽，含有47～84個氨基酸殘基，它們大都含有RGD三肽序列，通過與血小板膜表面整合素受體αⅡbβ3相互作用抑制血小板聚集。去整合素和類去整合素都富含高度保守的半胱氨酸結(jié)構(gòu)。從美洲西部菱斑響尾蛇(Crotalus atrox)蛇毒中獲取的Atrolysin E和來自于蝮蛇中的 Bilitoxin-1為 PⅡ型SVMP。

2．3 PⅢ型 SVMP

PⅢ型SVMP為高分子質(zhì)量出血性金屬蛋白酶，包含富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域和類去整合素樣結(jié)構(gòu)域，這兩個結(jié)構(gòu)域位于蛋白水解酶結(jié)構(gòu)域之后［20］。與PⅡ型不同，PⅢ型SVMP不含RGD結(jié)構(gòu)域，其類去整合素樣結(jié)構(gòu)域多數(shù)為Ser-Glu-Cys-Asp(SECD)。PⅢ型一般比PⅠ型具有更強的出血性，推測其富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域和類去整合素樣結(jié)構(gòu)域具有血小板聚集和增強SVMP的活性中起重要作用。大多數(shù)PⅢ型SVMP能夠抑制膠原蛋白和ADP誘導(dǎo)的血小板聚集。

2．4 PⅣ型 SVMP

PⅣ型SVMP除了包含蛋白水解酶結(jié)構(gòu)域、半胱氨酸結(jié)構(gòu)域和類去整合素樣結(jié)構(gòu)域外，還含有一個通過二硫鍵與上述三個結(jié)構(gòu)域連接的類C型凝集素結(jié)構(gòu)域［21］，來自Exhis carinatus蛇毒的RVV-X和carinactivase-1屬于此類。

3 sn-PLA2

sn-PLA2催化磷酸甘油三酯的第二位酯鍵水解，生成脂肪酸和溶血磷脂［22］。由于蛋白酶活性的高低與能否結(jié)合Ca2+息息相關(guān)，所以Lys49型sn-PLA2僅有較低的酶活性或者沒有酶活性。這類酶只作為實驗室研究的工具酶，特異性水解磷脂。

4 L-氨基酸氧化酶

蛇毒L-氨基酸氧化酶包括FAD結(jié)合結(jié)構(gòu)域、底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域和螺旋結(jié)構(gòu)域。一個底物結(jié)合結(jié)構(gòu)域和螺旋結(jié)構(gòu)域形成一個底物結(jié)合通道［23］。L-氨基酸氧化酶具有多種生物學(xué)功能，如誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、抑制或誘導(dǎo)血小板聚集、細(xì)胞毒性、抗菌活性、抗腫瘤活性以及殺寄生蟲等。目前推測，L-氨基酸氧化酶對血小板聚集的兩種不同效果，是由于酶活性的高低不同導(dǎo)致了反應(yīng)性血小板聚集所致。

5 5'-核苷酸酶

5'-核苷酸酶為單鏈糖蛋白，分子質(zhì)量約74 kD，EDTA和Zn2+對該酶活性有抑制作用［24］。不同種屬的蛇毒5'-核苷酸酶性質(zhì)不同，例如Fe3+離子不能完全抑制白唇竹葉青蛇毒的5'-核苷酸酶活性，但可以完全抑制竹葉青蛇蛇毒5'-核苷酸酶的活性。蛇毒5'-核苷酸酶對ADP、膠原及花生四烯酸誘導(dǎo)的人血小板聚集有抑制作用，其抑制作用是由于該酶能把AMP和ADP水解成腺苷和磷酸所致。

6 展望

蛇毒是巨大的天然藥庫，有多個成份已經(jīng)發(fā)展成藥品。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，越來越多的蛇毒蛋白的基因得到分離、鑒定和表達(dá)。本文綜述的研究進(jìn)展對進(jìn)一步闡明蛇毒蛋白酶的結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系及生物技術(shù)新藥研發(fā)打下基礎(chǔ)。

［1］ Mourada-Silva A M，Ramos O H，Baldo C，et al．Collagen binding is a key factor for the hemorrhagic activity of snake venom metalloproteinases［J］．Biochimie，2008，90(3):484-492．

［2］ Sant'Ana C D，Ticli F K，Oliveira L L，et al．BjussuSP-I:a new thrombin-like enzyme isolated from Bothrops jararacussu snake venom［J］．Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol，2008，151(3):443-454．

［3］ Tan N H．Isolation and characterization of the thrombin-like enzyme from Cryptelytrops purpureomaculatus venom［J］．Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol，2010，51(1):131-136．

［4］ 牟 萍，尹家榮，侯瑞鵬，等．長白山白眉蝮蛇蛇毒類凝血酶分離純化［J］．錦州醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2005，26(5):39-42．

［5］ Tang S S，Zhang J H，Tang B S，et al．Biochemical and hemostatic mechanism of a novel thrombin-like enzyme［J］．Thromb Res，2009，124(5):631-639．

［6］ Itoh N，Tanaka N，F(xiàn)unakoshi I，et al．Organization of the gene for

batroxobin，a thrombin-like snake venom enzyme．Homology with the trypsin/kallikrein gene family［J］．J Biol Chem，1988，263(16):7628-7631．

［7］ Pan H，Du X，Yang G，et al．cDNA cloning and expression of acutin［J］．Biochem Biophys Res Commun，1999，255(2):412-415．

［8］ Au L C，Lin S B，Chou J S，et al．Molecular cloning and sequence analysis of the cDNA for ancrod，a thrombin-like enzyme from the venom of Calloselasma rhodostoma［J］．Biochem J，1993，294(Pt 2):387-390．

［9］ Rokyta D R，Wray K P，Lemmon A R，et al．A high-throughput venom-gland transcriptome for the Eastern Diamondback Rattlesnake(Crotalus adamanteus)and evidence for pervasive positive selection across toxin classes［J］．Toxicon，2011，57(5):657-671．

［10］ Vilca-Quispe A，Ponce-Soto L A，Winck F V，et al．Isolation and characterization of a new serine protease with thrombin-like activity(TLBm)from the venom of the snake Bothrops marajoensis［J］．Toxicon，2010，55(4):745-753．

［11］ Costa F L，Rodrigues R S，Izidoro L F，et al．Biochemical and functional properties of a thrombin-like enzyme isolated from Bothrops pauloensis snake venom［J］．Toxicon，2009，54(6):725-735．

［12］ Costa J de O，F(xiàn)onseca K C，Mamede C C，et al．Bhalternin:functional and structural characterization of a new thrombin-like enzyme from Bothrops alternatus snake venom［J］．Toxicon，2010，55(7):1365-1377．

［13］ Bos M H，Boltz M，St Pierre L，et al．Venom factor V from the common brown snake escapes hemostatic regulation through procoagulant adaptations［J］．Blood，2009，114(3):686-692．

［14］ Fox J W，Serrano S M．Insights into and speculations about snake venom metallo-proteinase(SVMP)synthesis，folding and disulfide bond formation and their contribution to venom complexity［J］．FEBS J，2008，275(12):3016-3030．

［15］ Berger M，Pinto A F，Guimar?es J A．Purification and functional characterization of bothrojaractivase，a prothrombin-activating metalloproteinase isolated from Bothrops jararaca snake venom ［J］．Toxicon，2008，51(4):488-501．

［16］ Zhu L，Yuan C，Chen Z，et al．Expression，purification and characterization of recombinant jerdonitin，a P-Ⅱclasss nake venom metalloproteinase comprising metallo-proteinase and disintegrin domains［J］．Toxicon，2010．55(2-3):375-380．

［17］ Lambert L J，Bobkov A A，Smith J W，et al．Competitive interactions of collagen and a jararhagin-derived disintegrin peptide with the integrina2-Ⅰ domain［J］．J Biol Chem，2008，283(24):16665-16672．

［18］ Duncan R E，Sarkadi-Nagy E，Jaworski K，et al．Identification and functional characterization of adipose-specific phos-phorlipase A2(AdPLA)［J］．J Biol Chem，2008，283(37):25428-25436．

［19］ Sanchez E F，Schneider F S，Yarleque A，et al．The novel metalloproteinase atroxlysin-I from peruvian Bothrops atrox(Jergón)snake venom acts both on blood vessel ECM and platelets［J］．Arch Biochem Biophys，2010，496(1):9-20．

［20］ Hu P，Sun L，Zhu Z Q，et al．Crystal structure of Natratoxin，a novel snake secreted phospholipase A2 neurotoxin from Naja atra venom inhibiting A-type K+currents［J］．Proteins，2008，72(2):673-683．

［21］ Zuliani J P，Kayano A M，Zaqueo K D，et al．Snake venom L-amino acid oxidases:some consideration about their functional characterization［J］．Protein Pept Lett，2009，16(8):908-912．

［22］ Zhong S R，Jin Y，Wu J B，et al．Purification and characterization of a new L-amino acid oxidase from Daboia russellii siamensis venom［J］．Toxicon，2009，54(6):763-771．

［23］ Dhananjaya B L，D'Souza C J．The pharmacological role of nucleotidases in snake venoms［J］．Cell Biochem Funct，2010，28(3):171-177．

［24］陳 夏，余曉東，鄧 敏，等．白唇竹葉青蛇毒5'-核苷酸酶的分離純化及性質(zhì)［J］．動物學(xué)研究，2008，29(4):399-404．

Study on the snake venom proteases affecting the blood system

LI Hong-zhi，LIU Yu-chao，TANG Song-shan*
(Guangdong Key Laboratory of Pharmaceutical Bioactive Substances，School of Basic Courses，Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China)

R973

A

1005-1678(2012)06-0917-04

2012-04-20

廣東省中山市科技項目(編號:2009H015)

李紅枝，女，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事細(xì)胞遺傳毒理學(xué)研究，Email:lihong581110@163．com;劉玉超，男，共同第一作者，碩士研究生;*．唐松山，男，通信作者，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事蛋白生化藥學(xué)研究，Email:songstang@gmail．com．