任麗萍，孟姜姜，高志峰，范慧紅

(1．中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050;2．華東理工大學(xué)，上海 200237)

單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂鈉質(zhì)控研究進(jìn)展

任麗萍1，孟姜姜2，高志峰1，范慧紅1

(1．中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050;2．華東理工大學(xué)，上海 200237)

單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂鈉(GM1)是從豬腦中提取制得的對(duì)神經(jīng)細(xì)胞功能損傷具有作用的物質(zhì)。本文對(duì)近年來(lái)GM1質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、質(zhì)量控制和檢測(cè)方法進(jìn)行了綜述。

單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂鈉;檢測(cè)方法;質(zhì)控研究

神經(jīng)節(jié)苷脂(Gangliosides)是由Emst Klenk在1935年研究Niemann Pick病人組織內(nèi)脂類成分時(shí)發(fā)現(xiàn)。30多年前，Ceccarelli等首次把外源性的神經(jīng)節(jié)苷脂用于活體實(shí)驗(yàn)，以證實(shí)其提高損傷神經(jīng)元的再生能力。單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂鈉(Monosialotetrahexosylganglioside Sodium，GM1)系由親水的唾液酸寡糖基團(tuán)和神經(jīng)酰胺部分組成。GM1包括相對(duì)分子質(zhì)量為1 568．84和1 597．18的兩種單體。

GM1具有保護(hù)細(xì)胞膜、促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)、恢復(fù)神經(jīng)功能等作用，主要用于治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。GM1的檢測(cè)方法報(bào)道很多，包括高效液相色譜法(HPLC)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(LC-MS)、毛細(xì)管電泳法(CE)等，用于檢測(cè)提取過(guò)程中GM1的質(zhì)量控制、GM1制劑的質(zhì)量控制及其穩(wěn)定性考察。本文對(duì)我國(guó)市場(chǎng)上的GM1原料和制劑的質(zhì)控現(xiàn)狀進(jìn)行了綜述。

1 GM1的原料制備和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

GM1是由豬腦提取制得，我國(guó)GM1的原料生產(chǎn)企業(yè)已經(jīng)建立起規(guī)?；纳V分離和純化技術(shù)。原料的提取各家工藝并不完全一致，但基本都包括神經(jīng)節(jié)苷脂混合體的提取、神經(jīng)節(jié)苷脂鈉混合體的提取、GM1的提取以及GM1粗粉的純化等步驟。GM1原料的生產(chǎn)廠家7個(gè)，批準(zhǔn)文號(hào)7個(gè)。

經(jīng)國(guó)家藥監(jiān)局藥品數(shù)據(jù)庫(kù)查詢，GM1注射液的原研產(chǎn)品主要有阿根廷的施捷因和巴西的重塑杰。我國(guó)的GM1制劑主要有GM1注射液和注射用GM1兩種。其中，GM1注射液生產(chǎn)廠家7個(gè)，批準(zhǔn)文號(hào)11個(gè);注射用GM1生產(chǎn)廠家2個(gè)，批準(zhǔn)文號(hào)5個(gè)。原料和制劑的法定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)均為企業(yè)注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)。

2 生產(chǎn)現(xiàn)狀和存在的主要問(wèn)題

筆者實(shí)驗(yàn)室正開展對(duì)注射用GM1和GM1注射液的評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)工作，其中抽取了GM1注射液7個(gè)廠家、2個(gè)規(guī)格的53批次樣品，抽取了注射用GM1 2個(gè)廠家、2個(gè)規(guī)格的9批次樣品。分別按照各自注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)對(duì)樣品進(jìn)行了檢驗(yàn)，在檢驗(yàn)過(guò)程中我們發(fā)現(xiàn)各標(biāo)準(zhǔn)項(xiàng)目的設(shè)置和限度等均有較大差異，除性狀、澄清度、顏色和安全性檢查項(xiàng)目外，標(biāo)準(zhǔn)中差異較大的項(xiàng)目主要有含量測(cè)定和有關(guān)物質(zhì)檢查項(xiàng)。各企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)含量測(cè)定和有關(guān)物質(zhì)檢查方法一致，但流動(dòng)相的組成完全不同。由于各企業(yè)試行標(biāo)準(zhǔn)還未統(tǒng)一轉(zhuǎn)正，目前無(wú)GM1含量測(cè)定用國(guó)家對(duì)照品，因此，按各企業(yè)試行標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)的法定檢驗(yàn)結(jié)果還不能完全如實(shí)反應(yīng)產(chǎn)品質(zhì)量。

3 GM1的質(zhì)控研究

GM1在提取過(guò)程中可能引入其他神經(jīng)節(jié)苷脂類化合物，因此，檢測(cè)方法和檢測(cè)條件的選擇對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響很大，文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)構(gòu)研究比較少，含量和有關(guān)物質(zhì)的分析方法主要有HPLC法、HPCE法和LC-MS法。

3．1 結(jié)構(gòu)研究

王海龍等［1］以牛腦為原料，以國(guó)產(chǎn)硅膠代替進(jìn)口的Iatrobeads大顆粒硅膠，利用萃取、凝膠色譜的方法，從牛腦中提取了較高純度的神經(jīng)節(jié)苷脂，其紫外光譜最大吸收波長(zhǎng)為195 nm;通過(guò)紅外光譜研究證明在提純的產(chǎn)品結(jié)構(gòu)中含有唾液酸分子的結(jié)構(gòu)片段;利用原子力顯微鏡觀察其在水中的聚集體微觀形貌，在納米范圍內(nèi)得到了較為清晰的表面形貌圖，對(duì)其大小進(jìn)行了分析研究，為GM1的開發(fā)利用提供了理論依據(jù)。

3．2 含量測(cè)定

3．2．1 柱前衍生HPLC 徐桂蕓等［2］報(bào)道中的化學(xué)衍生方法包括全苯甲?；磻?yīng)、羰基與含氮親核試劑的加成反應(yīng)、唾液酸的羧基與酰甲基溴反應(yīng)。孫麗華等［3］通過(guò)選擇流動(dòng)相、色譜柱、衍生試劑等條件，研究建立了一種柱前衍生HPLC測(cè)定神經(jīng)節(jié)苷脂的分析方法，較為簡(jiǎn)便、快捷、結(jié)果準(zhǔn)確。

3．2．2 氨基柱 HPLC 由于柱前衍生 HPLC，操作繁瑣，條件苛刻，鄭永彪等［4］建立了GM1的離子對(duì)HPLC，采用 Lichrospher 100 NH2色譜柱，通過(guò)組成簡(jiǎn)單的流動(dòng)相、等度洗脫，不經(jīng)衍生而直接分離測(cè)定了GM1及其制劑的含量。劉勤等［5］報(bào)道中采用NH2柱對(duì)GM1進(jìn)行含量測(cè)定，考察了不同pH、流動(dòng)相配比及洗脫條件，結(jié)果表明在pH 5～6的范圍內(nèi)分離效果較好，并確定了最佳梯度洗脫條件。該法專屬性強(qiáng)，靈敏度較高，精密度好。尕瑞等［6］采用Lichrospher 100 NH2色譜柱建立了分離測(cè)定神經(jīng)節(jié)苷脂中唾液酸的HPLC方法。氨基鍵合相在酸性水溶液中可作為一種弱離子交換劑，與游離唾液酸、神經(jīng)節(jié)苷脂分子中唾液酸上的羧基和羥基作用而得以分離樣品中的各組分，簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，適用于唾液酸的測(cè)定及神經(jīng)節(jié)苷脂類藥品的生產(chǎn)及臨床應(yīng)用中的質(zhì)量控制。

3．2．3 反相柱法 由于神經(jīng)節(jié)苷脂的一端是親水的糖鏈，另一端是疏水的脂肪鏈，所以反相高效液相色譜更適合于它的分離。較早的文獻(xiàn)中報(bào)道了一些實(shí)驗(yàn)室使用十八烷基或辛基鍵合硅膠柱，甲醇-水作為流動(dòng)相，神經(jīng)節(jié)苷脂按其含唾液酸基數(shù)目的差異得以分離。反相柱不但可以分辨出相差一個(gè)糖殘基的神經(jīng)節(jié)苷脂，而且對(duì)于唾液酸在糖殘基連接位置不同的神經(jīng)節(jié)苷脂以及其它異構(gòu)體也有高的分辨率。劉勤等［7］報(bào)道了采用反相C18柱建立了注射液中GM1的含量測(cè)定方法，具有快速、準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)單、專屬性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。張小寧［8］研究了HPLC測(cè)定GM1含量的方法，比較了反相法C18柱、正相NH2柱和衍生化-反相C18柱三種測(cè)定方法，這三種方法都具有方法靈敏度較高，精密度好的優(yōu)點(diǎn)。

3．2．4 LC-MS 隨著色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的不斷發(fā)展，液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)也被應(yīng)用于神經(jīng)節(jié)苷脂的分析測(cè)定［9］。金一寶等［10］使用HPLC-MS法首次對(duì)奶粉中的GM1進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果表明，該法高效、靈敏、準(zhǔn)確度高，可用于奶粉中GM1的含量測(cè)定。

3．2．5 其他方法 電遷移方法，尤其是毛細(xì)管區(qū)帶電泳技術(shù)(CZE)，是應(yīng)用最廣泛的分析檢測(cè)糖類結(jié)構(gòu)的方法之一。因此，CZE也被用于分析測(cè)定單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂［11］，具有高效、快速、供試品及試劑消耗少等優(yōu)點(diǎn)。

3．3 有關(guān)物質(zhì)

劉勤等［7］采用HPLC對(duì)GM1原料中有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行了研究?？疾炝薈18柱和NH2柱的分離效果，結(jié)果表明只有NH2柱，采用了梯度洗脫方法能將GM1及各有關(guān)物質(zhì)完全分離。該法靈敏度較高，精密度好，專屬性強(qiáng)，是作為GM1有關(guān)物質(zhì)及降解產(chǎn)物檢查的可靠方法。

王華等［9］為了查找采用不同工藝生產(chǎn)的成品中造成臨床副反應(yīng)的可能雜質(zhì)，在反相C18柱基礎(chǔ)上，進(jìn)一步優(yōu)化條件，分離了GM1藥物的凍干粉、中間體和注射液，并對(duì)雜質(zhì)進(jìn)行了半制備級(jí)收集，用串聯(lián)質(zhì)譜對(duì)雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了鑒定。該法可用于鑒定GM1藥物中引起臨床不良反應(yīng)的微量雜質(zhì)。

4 結(jié)語(yǔ)

隨著GM1試行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)正統(tǒng)一和提高，對(duì)GM1質(zhì)量控制的要求也將越來(lái)越高。HPLC由于準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好的特點(diǎn)，在GM1含量測(cè)定和有關(guān)物質(zhì)檢查方面具有很大的優(yōu)勢(shì)。LC-MS由于可以提供更多的結(jié)構(gòu)信息，對(duì)于企業(yè)在GM1生產(chǎn)工藝改進(jìn)研究、穩(wěn)定性考察和臨床不良反應(yīng)研究方面更有優(yōu)勢(shì)。

GM1的原料來(lái)源于動(dòng)物臟器，提取工藝中又使用了大量的有機(jī)溶劑，高分子物質(zhì)可能是引起過(guò)敏等不良反應(yīng)，因此，GM1注射劑中的高分子物質(zhì)和殘留溶劑的控制是產(chǎn)品質(zhì)量控制的關(guān)鍵點(diǎn)，也是探討臨床不良反應(yīng)的新思路。筆者實(shí)驗(yàn)室正從事GM1注射劑的評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)工作，對(duì)國(guó)內(nèi)GM1注射劑的質(zhì)量狀況進(jìn)行探索性研究。

［1］ 王海龍，孫潤(rùn)廣，張 靜，等．神經(jīng)節(jié)苷脂的紅外、紫外光譜分析及其多聚體結(jié)構(gòu)的原子力顯微鏡觀測(cè)［J］．光譜學(xué)與光譜分析，2009，29(4);1045-1049．

［2］ 徐桂蕓，常理文．神經(jīng)節(jié)苷脂的高效液相色譜-化學(xué)衍生方法進(jìn)展［J］．色譜，1995，13(1):26-29．

［3］ 孫麗華，李 赟，王 茵．神經(jīng)節(jié)苷脂的柱前衍生-反相高效液相色譜測(cè)定研究［J］．中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2009，19(10):2211-2212．

［4］ 鄭永彪，范慧紅，徐康森，等．離子對(duì)高效液相色譜法分離測(cè)定單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂的含量［J］．藥物分析雜志，2004，24(2):135-136．

［5］ 劉 勤，謝劍煒．單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂鈉雜質(zhì)檢查及含量測(cè)定方法的研究［J］．藥物分析雜志，2005，25(2):153-156．

［6］ 尕 瑞，鄭永彪．高效液相色譜法分離測(cè)定神經(jīng)節(jié)苷脂GM1中唾液酸的含量［J］．青海醫(yī)藥雜志，2009，39(3):49-50．

［7］ 劉 勤，謝劍煒．單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂鈉注射液含量測(cè)定方法研究［J］．中國(guó)新藥雜志，2003，12(12):1024-1026．

［8］ 張小寧．高效液相層析測(cè)定單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂鈉含量方法的研究［J］．內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，29(6):411-415．

［9］ 王 華，徐 媛，梁 鋒，等．高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法分離鑒定單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂中的雜質(zhì)［J］．色譜，2009，27(1):29-33．

［10］金一寶，栗 暉，于治國(guó)，等．液質(zhì)聯(lián)用法測(cè)定奶粉中單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂(GM1)的含量［J］．沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，27(2):126-130．

［11］鄭永彪，范慧紅，丁春玲，等．毛細(xì)管區(qū)帶電泳法測(cè)定單唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂 GM1的含量［J］．中國(guó)生化藥物雜志，2004，25(3):139-141．

Research advances of quality control of monosialotetrahexosylganglioside sodium

REN Li-ping1，MENG Jiang-jiang2，GAO Zhi-feng1，F(xiàn)AN Hui-hong1
(1．National Institute for Food and Drug Control，Beijing 100050，China;2．East China University of Science and Technology，Shanghai 200237，China)

TQ460．72

A

1005-1678(2012)06-0925-02

2012-08-30

衛(wèi)生部2009年衛(wèi)生公益行業(yè)科研專項(xiàng)(子項(xiàng)目編號(hào):200902008-5)

任麗萍，女，碩士，助理研究員，研究方向:生化藥品質(zhì)量分析;范慧紅，女，通信作者，博士，研究員，研究方向:生化藥品質(zhì)量分析，Tel:010-67095349，E-mail:fanhuihong106@yahoo．com．cn。