袁志堅，周 紅，何曉升，何文涓

(1．無錫衛(wèi)生高等職業(yè)技術(shù)學(xué)校，江蘇 無錫 214028;2．杭州師范大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310016)

脂肪來源干細(xì)胞在移植脂肪中的分化及其相關(guān)miRNA的表達(dá)

袁志堅1，周 紅1，何曉升2，何文涓1

(1．無錫衛(wèi)生高等職業(yè)技術(shù)學(xué)校，江蘇 無錫 214028;2．杭州師范大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310016)

本文介紹脂肪來源干細(xì)胞(ADSCs)在移植脂肪中經(jīng)信號通路傳遞信號來調(diào)控ADSCs分化中轉(zhuǎn)入因子的活性，及其分化中miRNA的表達(dá)，闡明ADSCs成脂分化中的作用機(jī)制，另外，從ADSCs成脂分化中脂肪細(xì)胞的形態(tài)變化觀察其組織學(xué)特點及對幾種檢測手段的簡單介紹。

脂肪來源干細(xì)胞;成脂分化;轉(zhuǎn)錄因子;信號通路;miRNA

脂肪來源干細(xì)胞(ADSCs)來源豐富，可進(jìn)行自體移植，無免疫排斥反應(yīng)之慮，其低免疫源性使其可行同種異體移植甚至異體異種移植，這更加拓寬了其應(yīng)用范圍，而且取材簡便，有些是臨床治療后的副產(chǎn)品。ADSCs增殖能力非常強，據(jù)報道傳至第10代仍具較強向脂肪細(xì)胞定向分化的能力［1］。在整形外科中，ADSCs的移植可應(yīng)用于如皺紋的填充，痤瘡瘢痕凹陷的填充，皮脂腺囊腫切除后局部皮下組織的缺損的填充，乳腺癌切除后乳腺的重建等［2］。脂向分化是一個包括激素刺激、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達(dá)改變和細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變的復(fù)雜過程。多種轉(zhuǎn)錄因子形成的網(wǎng)絡(luò)狀的系統(tǒng)參與到整個脂向分化的過程中，miRNA是基因表達(dá)的一種重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，所以miRNA可能通過某些途徑調(diào)節(jié)成脂相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子參與到成脂分化的過程中，本文就ADSCs在移植脂肪過程中的分化及其miRNA的表達(dá)進(jìn)行綜述。

1 ADSCs的移植

ADSCs具有來源豐富、應(yīng)用范圍廣泛、成本低、無瘢痕、可調(diào)整等優(yōu)點，易于患者接受，在美容外科有廣闊的應(yīng)用前景。但是，單獨的顆粒脂肪移植有鈣化、囊腫形成、新生乳房腫瘤難以辨識等并發(fā)癥的可能，為克服常規(guī)注射脂肪移植的問題，目前引起最多關(guān)注的是ADSCs輔助移植法。Matsumoto等［3-4］將所取的顆粒脂肪分成兩部分:一部分用于提取ADSCs，一部分用于脂肪移植，提取后混合兩部分共同移植于小鼠皮下，使用ADSCs輔助移植的脂肪體積大于未使用脂肪移植組35%，使用ADSCs輔助移植的脂肪在 Dil染色下血管內(nèi)皮細(xì)胞較未使用脂肪移植組高，而且研究也證實ADSCs可以分化成脂肪細(xì)胞并促進(jìn)脂肪再生，又可以分化成血管內(nèi)皮細(xì)胞和壁細(xì)胞，促進(jìn)血管化作用，為脂肪細(xì)胞提供營養(yǎng)，并分泌血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和胰島素樣生長因子-1(IGF-1)等生長因子，防止脂肪細(xì)胞凋亡，因此可以說，ADSCs是維持脂肪移植成活的關(guān)鍵因素［5-6］。

2 ADSCs在移植脂肪中的分化情況

一般認(rèn)為，ADSCs向脂肪分化經(jīng)歷從多能干細(xì)胞、脂肪母細(xì)胞、前脂肪細(xì)胞、不成熟脂肪細(xì)胞到成熟脂肪細(xì)胞的過程。目前，人們對多能干細(xì)胞向前脂肪細(xì)胞分化的這一階段的研究較少，相比之下，前體脂肪細(xì)胞分化為成熟脂肪細(xì)胞的過程已經(jīng)基本闡明。然而，了解了這一過程的作用機(jī)制對ADSCs成脂分化有重要的意義。

2．1 調(diào)控ADSCs向分化的轉(zhuǎn)錄調(diào)控

脂肪細(xì)胞從成纖維細(xì)胞樣向圓形轉(zhuǎn)變的這種形態(tài)學(xué)上顯著的改變與細(xì)胞外基質(zhì)成分的水平、類型及細(xì)胞支架構(gòu)成的變化相平行。這些變化同樣也引起一些重要轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的變化，例如 PPARγ、SREBP-1c、ADD-1 和 C/EBPs，對前體脂肪細(xì)胞向成熟脂肪細(xì)胞分化和基因表達(dá)模式的轉(zhuǎn)變起了決定性的開啟作用。

2．1．1 PPARγ PPARγ屬于核受體超家族配體依賴的轉(zhuǎn)錄因子，是抗糖尿病藥物噻唑烷二酮類的靶點。PPARγ的表達(dá)對于白色脂肪組織和棕色脂肪組織的形成都是必需的［7-8］。多能干細(xì)胞經(jīng)PPARγ表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染可誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞生成，促使3T3-L1前體脂肪細(xì)胞在無誘導(dǎo)劑存在的情況下，向終末脂肪細(xì)胞轉(zhuǎn)化。PPARγ缺乏的小鼠可因胎盤缺陷而在胚胎期死亡，單純?nèi)コ齈PARγ基因的ADSCs既不能分化為脂肪細(xì)胞，也不能參與脂肪組織的形成。

PPARγ由兩種可選擇的啟動子轉(zhuǎn)錄并形成兩種轉(zhuǎn)錄本，即PPARγ1和 PPARγ2。PPARγ2特異性表達(dá)于脂肪細(xì)胞中且隨脂肪細(xì)胞分化表達(dá)上調(diào)，是脂肪細(xì)胞分化的決定性因子。應(yīng)用重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)小鼠PPARγ2基因在NIH3T3成纖維細(xì)胞中表達(dá)，油紅O染色證實，表達(dá)PPARγ2的NIHT3T3成纖維細(xì)胞在分化介質(zhì)中培養(yǎng)分化10 d后，胞漿中明顯積聚了較多的中性脂肪，其細(xì)胞形態(tài)也與體內(nèi)成熟脂肪細(xì)胞相似，而且這些細(xì)胞表達(dá)脂肪細(xì)胞特異性標(biāo)志基因。這些研究結(jié)果充分顯示，PPARγ在脂肪細(xì)胞分化中發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用［9］。

2．1．2 SREBP-1c 類固醇調(diào)節(jié)原件蛋白(SREBP)，是近年來在肝臟中發(fā)現(xiàn)的一類能夠調(diào)控不飽和脂肪酸的合成、葡萄糖的代謝以及膽固醇合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。SREBP有三種亞型，即 SREBP-1a，SREBP-1c和 SREBP-2。其中，SREBP-1c在脂肪細(xì)胞中高表達(dá)，具有促進(jìn)3T3-L1前體脂肪細(xì)胞分化的作用。另外有研究表明，SREBP-1c在脂肪細(xì)胞中促進(jìn)甘油三酯的合成主要通過以下兩種方式:①上調(diào)脂肪酸合成酶、乙酰輔酶A脫羧酶、硬脂酰輔酶A去飽和酶、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶等基因表達(dá)促進(jìn)甘油三酯合成;②轉(zhuǎn)錄激活PPARγ表達(dá)或通過誘導(dǎo)PPARγ配體表達(dá)而增加其生脂活性，促進(jìn) ADSCs分化［10］。

2．1．3 ADD-1 ADD-1是 SREBP家族的一種，能夠與PPARγ基因的啟動子結(jié)合，在脂肪組織中大量表達(dá)。因此，ADD-1也是調(diào)控脂肪細(xì)胞分化的重要轉(zhuǎn)錄因子。在前體脂肪細(xì)胞的分化過程中，ADD-1的表達(dá)升高，3T3-L1前體脂肪細(xì)胞中過度表達(dá)ADD-1/SREBP-1c可以誘導(dǎo)脂肪細(xì)胞特異性基因的表達(dá)。PPARγ本身可能就是ADD-1/SREBP-1c作用的一個靶基因，所以ADD-1發(fā)揮作用可能是通過調(diào)控PPARγ的表達(dá)和激活來進(jìn)行的。

盡管目前ADD-1的表達(dá)調(diào)控及其調(diào)控脂肪細(xì)胞分化的作用機(jī)制尚未被完全闡明，但是大量的實驗揭示其在胰島素介導(dǎo)的脂肪細(xì)胞分化過程中發(fā)揮著重要的作用。

2．1．4 C/EBPs C/EBPs屬于高度保守的亮氨酸鋅指蛋白家族，包括α、β和δ三種亞型。C/EBPα的表達(dá)在 PPARγ之后，在脂肪細(xì)胞終末分化中發(fā)揮重要作用。此外，C/EBPα能夠有效促進(jìn)小鼠成纖維細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化。C/EBPα在細(xì)胞分化早期有抑制有絲分裂的作用，在啟動細(xì)胞分化和保持脂肪細(xì)胞形態(tài)中有重要作用。敲除C/EBPα的小鼠體內(nèi)不形成白色脂肪組織，表明C/EBPα在脂肪組織發(fā)育中起到關(guān)鍵作用。Lefterova等［11］最近研究揭示，PPARγ和 C/EBPα靶基因具有共區(qū)域化的特征。C/EBPβ和C/EBPδ是ADSCs分化早期的調(diào)控因子，主要能夠通過誘導(dǎo)PPARγ和C/EBPα的表達(dá)而啟動生脂信號，但隨ADSCs分化其表達(dá)量逐漸減少。研究表明，C/EBPβ和C/EBPδ基因敲除鼠脂肪組織發(fā)育受損，而C/EBPβ和C/EBPδ基因缺失的ADSCs成脂分化能力也顯著下降。

2．2 調(diào)控ADSCs脂向分化的信號通路

多種激素和生長因子在ADSCs分化過程中發(fā)揮著重要的作用。這些激素或生長因子在作用于脂肪細(xì)胞膜表面的特異受體后，經(jīng)不同信號通路的信號傳遞，通過直接或間接的修飾調(diào)控ADSCs分化的轉(zhuǎn)錄因子活性，而實現(xiàn)對ADSCs分化的調(diào)控。主要的四條信號傳導(dǎo)途徑為:①MAPK途徑;②胰島素和IGF-1激活的酪氨酸激酶途徑;③TGF-β/BMPs途徑;④FGFs信號通路等。

2．2．1 MAPK 通路與 ADSCs分化 Auld 等［12］認(rèn)為 MAPK通路可使多種核轉(zhuǎn)錄因子和蛋白激酶等多種底物磷酸化，從而調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，參與細(xì)胞生長、發(fā)育及細(xì)胞間的功能同步等多種生理過程。由于ADSCs分化本身是一個多步驟、多調(diào)控因素的復(fù)雜過程，MAPK可能參與調(diào)控每個環(huán)節(jié)。因此，MAPK對其的調(diào)節(jié)也是復(fù)雜多樣的，在不同階段發(fā)揮不同的作用。

2．2．2 胰島素/IGF-1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與 ADSCs分化 胰島素/IGF-1是最早被發(fā)現(xiàn)能夠促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化的因子。由于脂肪細(xì)胞表面的胰島素受體很少，大多是通過IGF-1受體激活的PI3K/Akt通路發(fā)揮其作用的。PI3K激活A(yù)kt/PKB后，GLUT1和GLUT4轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜上，攝取葡萄糖，使脂肪細(xì)胞中甘油三酯合成增加，導(dǎo)致ADSCs分化［13］。

2．2．3 TGF-β/BMPs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與 ADSCs分化 TGF-β 及其信號組分在體外培養(yǎng)的脂肪細(xì)胞和脂肪組織中均有表達(dá)。但是，TGF-β在體外培養(yǎng)條件下能抑制前體脂肪細(xì)胞的分化，超表達(dá)TGF-β會損害脂肪組織的發(fā)育。阻斷內(nèi)源性的TGF-β通路能促進(jìn)脂肪形成。

BMPs對ADSCs的作用又依賴于BMP的類型和濃度，以及前體細(xì)胞的類型和其他調(diào)節(jié)物的參與。BMP2的功能更復(fù)雜并依賴于其他信號分子的參與。BMP4能使ADSCs定向為脂肪細(xì)胞譜系，并完成向脂肪細(xì)胞的分化。小鼠缺乏BMP2和BMP4都會在胚胎發(fā)育早期死亡，而這時脂肪細(xì)胞還沒有開始發(fā)育，因此，BMP2和BMP4的作用還有待深入研究。但是，Jin等［14］的研究表明，BMP信號通路的中間物Schnurri2(SHN2)在體內(nèi)和體外都是成脂分化所必須的，其功能是作為連接Smad1，Smad4和C/EBPα與PPARγ啟動子的支架。

2．2．4 FGFs信號與 ADSCs分化 最近的研究表明，F(xiàn)GFs在脂肪形成中發(fā)揮著積極的作用。FGF1是微血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放的一種物質(zhì)，它在人前體脂肪細(xì)胞中具有促成脂活性。FGF2植入小鼠子宮，甚至耳軟骨或肌肉中都能誘導(dǎo)脂肪組織的發(fā)育。FGF10在白色脂肪組織的間質(zhì)脈管細(xì)胞中表達(dá)，也在3T3-L1細(xì)胞脂肪形成的早期表達(dá)。

2．3 ADSCs在成脂分化過程中細(xì)胞的組織學(xué)特點及其相關(guān)檢測

ADSCs經(jīng)成脂誘導(dǎo)3 d后，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞體積增大，由梭形變?yōu)閳A形或多角形，最為顯著的改變是細(xì)胞呈多極突起，且突起細(xì)長，而且位于核周的小部分細(xì)胞質(zhì)內(nèi)開始出現(xiàn)很小的折光性很強的脂滴。誘導(dǎo)后7 d，部分細(xì)胞脂滴增多，有的脂滴聚集成較大的脂泡，脂肪細(xì)胞呈灶狀分布。誘導(dǎo)后14 d，絕大部分細(xì)胞已變成脂肪細(xì)胞，細(xì)胞多呈圓形或橢圓形，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見大量脂滴［15］。油紅 O染色可見脂滴被染成紅色，呈強陽性［16］。對照組僅有極少數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)脂滴聚集，大多細(xì)胞油紅O染色呈陰性。此外，也可以抽取誘導(dǎo)7～10 d的脂肪細(xì)胞的總RNA，RT-PCR檢測脂肪細(xì)胞的特異性基因PPARγ的表達(dá)，利用圖像分析軟件分析PCR產(chǎn)物/β-actin灰度比值［17］。當(dāng)然還有其他檢測方法可以證實ADSCs的成脂分化，如定位熒光標(biāo)記細(xì)胞，伊紅染色等。

3 ADSCs脂向分化過程中miRNA的表達(dá)

脂肪細(xì)胞分化過程受到大量miRNA影響，其中一些miRNA能夠顯著地調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞的分化，如miR-16、miR-17-92、miR-21、miR-27a、miR-27b、和 miRNA-134 等。

3．1 miR-16

miR-16是miRNAs中的一員，其作用十分廣泛。Wang等［18］認(rèn)為miR-16等microRNA的表達(dá)變化可以控制細(xì)胞的生長速度;Calin等［19］認(rèn)為miR-16通過BCL2(細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)子)調(diào)控細(xì)胞凋亡，miR-16還參與調(diào)控細(xì)胞因子的RNA的不穩(wěn)定性。結(jié)果顯示miR-16在脂肪基質(zhì)細(xì)胞脂向分化過程中表達(dá)顯著下調(diào)，所以推測miR-16可能通過調(diào)控PPARγ、SREBP-1c、ADD1和C/EBPs等在脂肪基質(zhì)細(xì)胞脂向分化過程中重要的轉(zhuǎn)錄因子中的一種或幾種，從而在ADSCs脂向分化過程發(fā)揮作用［20］。

3．2 miR-17-92

Wang等［21］的研究表明，miR-17-92通過靶向 Rb2/p130的mRNA而促進(jìn)前體脂肪細(xì)胞分化。前體脂肪細(xì)胞發(fā)生融合和生長抑制后，再在激素等的刺激下進(jìn)入細(xì)胞周期，才開始分化。然而在此期間，轉(zhuǎn)錄因子E2F作用于細(xì)胞由G1期向S期的轉(zhuǎn)化，而Rb2/p130與E2F的結(jié)合抑制了E2F功能的發(fā)揮進(jìn)而抑制了細(xì)胞分化。miR-17-92能結(jié)合在Rb2/p130的RNA上，通過減少Rb2/p130的表達(dá)促進(jìn)脂肪細(xì)胞的分化［22］。

3．3 miR-21

王偉新等［23］研究表明，miRNA-21的表達(dá)在 ADSCs脂向分化過程中顯著下調(diào)，并經(jīng)實時定量聚合酶鏈反應(yīng)實驗證實這一結(jié)果，提示 miRNA-21參與了 ADSCs的脂向分化過程，所以推測 miRNA-21可能通過 PPARγ、SREBP-1c、ADD1和C/EBPs等轉(zhuǎn)錄因子，在ADSCs的成脂分化中調(diào)控信號傳導(dǎo)通路，實現(xiàn)其在ADSCs成脂方向的作用。

3．4 miR-27a和 miR-27b

肖金剛等［24］的研究顯示，miR-27a和miR-27b在 ADSCs向脂肪細(xì)胞分化的過程中表達(dá)顯著下調(diào)。miR-27a和miR-27b可調(diào)控個體的早期發(fā)育和細(xì)胞分化，通過作用于抗血管形成的基因而促進(jìn)血管發(fā)生［25］。生物信息學(xué)分析表明PPARγ是miR-27a和 miR-27b的靶基因之一，PPARγ是脂肪細(xì)胞發(fā)育和脂肪形成過程中特異的核心轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，可促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化，所以miR-27a和miR-27b可能是通過調(diào)控PPARγ的表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)ADSCs的脂向分化。

3．5 miR-134

miR-134作為miRNA家族中的成員之一，可以單獨促進(jìn)人類胚胎干細(xì)胞的分化。王黎等［26］研究證實，miR-134在ADSCs脂向分化過程中表達(dá)顯著下調(diào)，原因可能是miR-134與抑制凋亡的基因 Bcl-2、Bcl-XL、Bcg-l、Tbx3(T-box3)等中的一種或幾種翻譯出的mRNA結(jié)合減少，降低或消除對這些基因的抑制，使抑制凋亡的基因發(fā)揮作用，參與MAPK、Insulin/IGF-1、TGFβ/BMPs和 FGFs等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，為 ADSCs向脂肪細(xì)胞方向分化創(chuàng)造促進(jìn)條件。

4 結(jié)語

ADSCs的成脂分化受各種miRNA的影響，經(jīng)不同信號通路的信號傳遞，通過直接或間接的修飾調(diào)控ADSCs分化的轉(zhuǎn)錄因子活性，從而實現(xiàn)對ADSCs分化為成熟脂肪細(xì)胞并部分參與構(gòu)成移植物脂肪的調(diào)控。另外，ADSCs在移植后的急性期處于缺氧的環(huán)境，可以以旁分泌的形式釋放可溶性血管形成因子，促進(jìn)移植物的新生血管形成，使得更多的脂肪組織更早的建立血運，獲取營養(yǎng)，提高其存活率，所以，ADSCs輔助移植作為一種細(xì)胞療法具有一定意義，但能否解決臨床上ADSCs移植的根本問題，仍需進(jìn)一步研究。

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Differentiation and miRNA expressiom of adipose-derived stem cells in fat transplantation

YUAN Zhi-jian1，ZHOU Hong1，HE Xiao-sheng2，HE Wen-juan1
(1．Wuxi Higher Health Vocational Technical School，Wuxi 214028，China;2．School of Clinical Medicine，Hangzhou Normal University，Hangzhou 310016，Chian)

Q813

A

1005-1678(2012)06-0924-04

2012-06-21

江蘇省衛(wèi)生廳衛(wèi)生科研項目(編號:J201117)

袁志堅，男，副教授，E-mail:yzj0126@yahoo．com．cn;何曉升，男，通信作者，E-mail:hexs@163．com。