畢赤酵母在基因克隆與表達中的應(yīng)用

占今舜，宋虎威，陳宇光，李麗立，張 彬*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長沙 410128；2. 中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所 動物生態(tài)營養(yǎng)與健康養(yǎng)殖聯(lián)合實驗室，農(nóng)業(yè)生態(tài)工程重點實驗室，長沙 410125）

隨著分子生物學(xué)及基因工程的發(fā)展，利用自身基因在外源細胞中的克隆與表達也受世人關(guān)注。生物表達系統(tǒng)的出現(xiàn)滿足了科學(xué)發(fā)展的要求，并漸漸成為處理工農(nóng)生產(chǎn)以及醫(yī)療衛(wèi)生等領(lǐng)域問題的重要手段之一[1]。近年來，蛋白表達系統(tǒng)已有原核表達系統(tǒng)、真核表達系統(tǒng)、哺乳動物表達系統(tǒng)和昆蟲細胞表達系統(tǒng)等。不同的表達系統(tǒng)，其有不同的特點。如原核表達系統(tǒng)主要是大腸桿菌，其表達體系相對簡單，目的蛋白無法經(jīng)過修飾加工，對于有復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)的蛋白就不宜用此表達系統(tǒng)[2]；哺乳動物表達系統(tǒng)，技術(shù)研究不夠成熟，外源基因在動物體內(nèi)容易受到排斥，導(dǎo)致表達不穩(wěn)定，表達代價相對其他表達系統(tǒng)高很多；昆蟲細胞表達系統(tǒng)，缺陷主要是表達量不足，而且容易產(chǎn)生錯誤的糖基化修飾[3]；真核表達系統(tǒng)主要是酵母體系，其中對畢赤酵母（Pichia pastoris）的研究最為熱門，該體系既有糖基化程度不高，對目的蛋白污染小，對生長環(huán)境要求不高，其培養(yǎng)基易配置，便于高密度發(fā)酵表達等特點，又具有強效的啟動子，還可對復(fù)雜的外源蛋白的高級結(jié)構(gòu)進行翻譯后加工折疊和修飾過程，比如糖基化、蛋白折疊及生成二硫鍵等，是一種優(yōu)秀的真核生物表達系統(tǒng)[4]。經(jīng)過多年的研究發(fā)展，畢赤酵母表達系統(tǒng)已成為一個相對成熟和理想的蛋白表達系統(tǒng)，被國內(nèi)外廣泛應(yīng)用于工農(nóng)生產(chǎn)以及醫(yī)療衛(wèi)生等領(lǐng)域。目前，已有數(shù)百種外源蛋白在畢赤酵母表達系統(tǒng)中獲得表達。

1 畢赤酵母表達系統(tǒng)

畢赤酵母是甲醇酵母下的一個屬，能在含有甲醇的培養(yǎng)基上快速生長。其本身的強效啟動子——醇氧化酶基因（AOX）是其他酵母表達系統(tǒng)無法比擬的[5]。醇氧化酶只能以甲醇作為誘導(dǎo)劑，葡萄糖和甘油只會阻礙AOX啟動子的調(diào)控途徑，抑制外源基因的表達。因此，當(dāng)培養(yǎng)基中只有甲醇時，AOX啟動子就能強效嚴格的調(diào)控外源基因的表達[6]。研究發(fā)現(xiàn)，畢赤酵母兼?zhèn)湓撕驼婧藘煞N表達系統(tǒng)的優(yōu)點。其優(yōu)點如下：

1）經(jīng)過對畢赤酵母的研究，其全基因組序列已經(jīng)完全被弄清楚，其基因表達機制及調(diào)控也被研究比較透徹，實際運用操作簡單可行；

2）畢赤酵母中含有醇氧化酶（AOX）強效啟動子，在甲醇的作用下，能以接近于大腸桿菌的繁殖速度迅猛生長，強效的調(diào)控外源基因表達；

3）畢赤酵母具有完整的線粒體，高爾基體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等亞細胞結(jié)構(gòu)，能使結(jié)構(gòu)復(fù)雜的外源蛋白在畢赤酵母體系中表達，并對復(fù)雜外源蛋白的高級結(jié)構(gòu)進行翻譯、加工、折疊和修飾，使目的蛋白具有一定的生物活性；

4）畢赤酵母能與一些分泌型表達載體構(gòu)建表達體系，使外源基因轉(zhuǎn)化入酵母體系后，目的蛋白能分泌表達到培養(yǎng)液中，從而降低菌體胞內(nèi)蛋白水解酶對目的蛋白的威脅，也很大程度地方便了目的蛋白的分離純化工作；

5）畢赤酵母表達體系不會產(chǎn)生內(nèi)毒素，也不會出現(xiàn)特異性病毒或支原體污染等問題，它不會對人體及自然環(huán)境的安全造成危害。

1.1 畢赤酵母表達宿主菌

畢赤酵母作為一種甲醇利用型酵母菌，主要包括Candida 和Pichia 2個種屬。當(dāng)前，用于外源基因表達的畢赤酵母菌株一般由Invitrogen公司構(gòu)建，主要有 NRRL-Y11430，GS115，KM 71，MC100-3，SMD1163，SMD1165和SMD1168等。 其 中NRRL-Y11430為野生型，其具有多個醇氧化酶基因啟動子，需要利用大量甲醇來繁殖，由于大量的甲醇儲存容易引發(fā)火災(zāi)，故在實際生產(chǎn)中不常用。而常用的則是通過對野生型表達菌株NRRL-Y11430的1種或多種醇氧化酶基因啟動子進行剔除或替換改造而 得 到 的 GS115，KM71，MC100-3，SMD1163，SMD1165和 SMD1168等。另外，研究表明，在一定程度上，經(jīng)過改造的菌株比野生型菌株更具有表達外源蛋白的優(yōu)勢。目前，應(yīng)用最廣泛的宿主菌為GS115，該菌既有AOX1，又具有AOX2，使其在含有甲醇的培養(yǎng)基上能夠迅速生長，大量地表達外源基因，其表型為Mut+。 KM71菌中只具有AOX2，其 AOX1基因被替換，而AOX2基因?qū)状祭媚芰^弱，因此為甲醇利用緩慢型，其表型為Muts[7]。另外，它必須在含有精氨酸外源供給的培養(yǎng)環(huán)境生長。MC100-3菌既不具有AOX1，也不具有AOX2，使其不利用甲醇，其表型為Mut－。SMD1165，SMD1165 和SMD1168均含有AOX1基因，能在甲醇培養(yǎng)基中生長。但它們基因組中缺失編碼蛋白酶A（pep4）和（或）編碼蛋白酶B（prb1）的基因，大大降低或清除了蛋白酶A、蛋白酶B以及羧肽酶Y這3種酶的活性，故稱為蛋白酶缺陷型菌株。由于降低或清除了蛋白酶，減弱了蛋白酶對外源蛋白的降解作用。因此，適用于分泌型表達。但其也具有明顯的缺點，其生長速度比較慢，外源蛋白的表達效率不高，不太適用于大規(guī)模生產(chǎn)。

1.2 畢赤酵母表達載體

畢赤酵母的表達載體一般為既能在大腸桿菌中表達又能在酵母細胞中表達的穿梭型質(zhì)粒。畢赤酵母細胞中的自然質(zhì)粒穩(wěn)定性都不佳, 只有將外源基因整合到宿主細胞的染色體基因組DNA，才能順利實現(xiàn)外源表達。常用的整合位點處在酵母基因組中的AOX1或HIS4基因位置。目前，常用的巴斯德畢赤酵母表達載體的基因序列包含有乙醇氧化酶基因5′AOX1啟動子和3′AOX1終止子，多克隆位點（MCS），組氨酸脫氫酶基因（His4）營養(yǎng)缺陷型篩選標記和復(fù)制起點（ori）。另外，分泌型載體 如：pPICZα、pPIC9 和 pPIC9K，都含有能調(diào)控外源表達蛋白分泌到胞外的信號肽序列α-factor序列。

1.2.1 啟動子

畢赤酵母表達最常用的啟動子是醇氧化酶AOX1。當(dāng)有甲醇存在時，該啟動子就會被誘導(dǎo)和調(diào)控，幫助外源基因高效表達。Yu[8]利用AOX1啟動子表達了超氧化物歧化酶（SOD）；Ghaffar 等[9]將目的基因整合入畢赤酵母GS115 中，利用表達載體的AOX1高效表達了來自嗜熱毛殼菌的耐熱木聚糖酶。由于甲醇對人體有毒害作用以及大量使用，容易帶來火災(zāi)隱患，在實際生產(chǎn)生活中存在一定的風(fēng)險。因此，使不用甲醇作為碳源誘導(dǎo)的啟動子備受關(guān)注，如依賴谷胱甘肽的甲醛脫氫酶啟動子（FLD1）和三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子（GAP）。研究人員利用GAP啟動子成功誘導(dǎo)表達乙肝表面抗原、人類巨噬細胞集落刺激因子（hGM-CSF）和α-淀粉酶。另外，構(gòu)建重組畢赤酵母時，根據(jù)所表達的外源蛋白的特性和需要，也可以同時利用AOX1和GAP兩個啟動子構(gòu)建表達載體和重組酵母。呂中原等[10]在利用重組畢赤酵母表達S-腺苷甲硫氨酸合成酶時，既采用了GAP啟動子又采用了AOX啟動子，這兩個啟動子的同時存在能在一定程度上提高表達產(chǎn)量。

1.2.2 篩選標記

酵母表達載體上的篩選標記不僅可以提高陽性轉(zhuǎn)化子，還可以提高高拷貝轉(zhuǎn)化子的篩選效率。如果載體篩選標記選擇恰當(dāng)，可以使操作簡單易行。當(dāng)前，篩選標記主要有兩大類，即營養(yǎng)缺陷型基因和抗性基因。營養(yǎng)缺陷型是因某一個特定氨基酸基因的缺失而常被用作陽性轉(zhuǎn)化子的篩選標記，其包括his4、suc2、arg4等類型。抗性基因是依據(jù)基因劑量效應(yīng)和按對抗生素的抗性水平來快速篩選出高拷貝轉(zhuǎn)化子，其有G418和Zeocin等類型。目前，通常是先利用營養(yǎng)缺陷型基因篩選出陽性重組子，然后再利用重組子的抗性基因篩選高拷貝數(shù)重組子。然而，Lin-cereghino等[11]構(gòu)建了新的表達載體pKANB 和pKANαB，此類載體上含有修飾過的Tn903kan′基因，可通過對G418的抗性直接篩選出高拷貝的酵母重組子，而且新構(gòu)建的表達載體不大，實際操作更簡單且易行。

1.2.3 信號肽

像pPICZα、pPIC9和pPIC9k分泌型表達載體通常有一段信號肽序列α-factor。對于酵母本身，其分泌的蛋白較少，如能實現(xiàn)外源蛋白的胞外分泌性表達，不僅減輕宿主細胞的代謝負荷，還減少宿主細胞蛋白水解酶對目的蛋白的降解，這為目的蛋白后期的純化具有重要的作用，所以選擇合適的信號肽是提高外源蛋白表達效率的關(guān)鍵。通?？晒┻x擇的信號肽分為兩類: 酵母表達載體自身的信號肽和基因本身的信號肽。Yang等[12]研究發(fā)現(xiàn)，菌體胞外分泌表達常用的且最為有效的信號肽是α因子前導(dǎo)肽序列（α-factor） ，它可以通過AOX1 啟動子來起始轉(zhuǎn)錄，從而使目的蛋白合成與菌體胞外分泌。Dong 等[13]通過α-MF 信號肽的介導(dǎo)，將克隆到畢赤酵母載體中的犀牛乳鐵蛋白基因成功表達到菌體細胞外。另外，姚清俠等[14]研究發(fā)現(xiàn)，外源基因本身的信號肽也能引導(dǎo)外源蛋白的分泌表達, 但酵母表達載體自身信號肽可能要優(yōu)于外源基因蛋白的信號肽，而且信號肽具有選擇性，這就意味著在外源蛋白分泌型表達的應(yīng)用中，可以考慮摘除外源基因的信號肽。

2 外源蛋白的高效表達

由于畢赤酵母自身分泌蛋白少，因此表達的目的外源蛋白在菌體外的培養(yǎng)環(huán)境中的純度較高。研究表明，巴斯德畢赤酵母表達系統(tǒng)表達的外源蛋白水平可達到g/L。Huang等將克隆到畢赤酵母中的截短1，3-1，4-β-D-葡聚糖酶基因成功表達，其表達量高達3 g/L；Hao等通過巴斯德畢赤酵母蛋白表達系統(tǒng)表達的重組人復(fù)合α-干擾素(cIFN) 也達到1.24 g/L的水平。另外，有研究報道說明，并不是所有的外源蛋白都可以在畢赤酵母表達系統(tǒng)中高效表達，仍然有很多外源蛋白的表達效果不理想。在同一表達系統(tǒng)中表達不同的外源蛋白，其表達量千差萬別，這是因為外源基因在畢赤酵母表達系統(tǒng)中高效表達受多方面因素的綜合影響，如外源基因的自身性質(zhì)、酵母的培養(yǎng)環(huán)境、表達的外源蛋白的特性等。研究發(fā)現(xiàn)，可以通過優(yōu)化外源基因的內(nèi)部密碼子結(jié)構(gòu)、完善培養(yǎng)環(huán)境、抑制蛋白酶的降解作用和優(yōu)化發(fā)酵參數(shù)等方法來達到外源蛋白高效表達的效果。

外源基因的自身特性與表達該外源基因的畢赤酵母的特性是否相匹配，是影響外源蛋白表達與否或表達效率的重要因素之一。受影響的外源基因自身特性主要包括基因序列的UTR序列(mRNA 5′端非翻譯區(qū))、A+T含量比、基因拷貝數(shù)和偏愛密碼子的出現(xiàn)頻率4個方面。