劉 建，湯德元*，羅險峰，李春燕，甘振磊，王 鳳，郝 飛

(1.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州省動物疫病預(yù)防控制中心，貴州 貴陽 550008)

豬細(xì)小病毒病是由豬細(xì)小病毒(porcine parvovirus，PPV)引起的母豬繁殖障礙疾病之一，該病的主要特征為感染母豬，特別是感染初產(chǎn)母豬后導(dǎo)致流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、畸形胎、木乃伊胎及帶病弱仔豬等，同時，PPV還與非化膿性心肌炎、皮炎、腸炎及病毒血癥等有關(guān)[1]。豬細(xì)小病毒是Mary和Mahnel于1966年在用豬腎原代細(xì)胞進(jìn)行豬瘟病毒組織培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)的，隨后被鑒定為一種DNA病毒。Cartwight等[2]首次證實了其致病性。自20世紀(jì)60年代中期以來，歐洲、美洲、亞洲等很多國家分離到該病毒或檢測出其抗體。國內(nèi)潘雪珠等（1982）在上海首次分離到該病毒，此后在全國不同省份均有分離到PPV的報道。由于妊娠母豬感染該病毒后臨床癥狀不明顯，而且該病毒對理化因素的抵抗力很強(qiáng)，造成該病在世界范圍內(nèi)廣泛傳播和流行，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，因此受到了高度重視，國內(nèi)外對該病毒的研究也逐漸深入。

當(dāng)前，對PPV的快速檢測是有效控制和消滅該病的前提。豬細(xì)小病毒感染可依據(jù)臨床癥狀和流行病學(xué)做出初步診斷，—般認(rèn)為，如果僅妊娠母豬發(fā)生流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎、胎兒發(fā)育異常等狀況而母豬本身無明顯癥狀，同時有證據(jù)表明是傳染性疾病時，則應(yīng)考慮到PPV感染的可能。但是本病與豬偽狂犬病、豬乙型腦炎和豬布魯氏菌病的臨診癥狀非常相似。因此，確診必須進(jìn)行實驗室診斷。目前已建立了許多PPV檢測及診斷方法，現(xiàn)將研究結(jié)果綜述如下。

1 臨床診斷

母豬在不同的懷孕期感染PPV后的癥狀不同。在懷孕30～50 d之間感染時，主要是產(chǎn)木乃伊胎；懷孕50～60 d之間感染時，主要是出現(xiàn)死胎；懷孕70 d左右感染時，主要是出現(xiàn)流產(chǎn)癥狀；在懷孕70 d后，大多數(shù)胎兒由于對病毒感染產(chǎn)生免疫反應(yīng)而存活，但體內(nèi)常帶有抗體和病毒。對病死豬的解剖可見其主要病變是母豬有輕度子宮內(nèi)膜炎，胎盤部分鈣化；大多數(shù)死胎、死仔或弱仔皮膚和皮下可見充血或水腫，胸腔、腹腔積有淡紅或淡黃色滲出液，肝、肺、腎有時腫大脆弱或萎縮發(fā)暗，個別死胎皮膚出血，弱仔生后10 h先在耳尖，后在頸、胸、腹部及四肢末端內(nèi)側(cè)出現(xiàn)淤血、出血斑，半日內(nèi)皮膚全部變紫而死亡。若僅僅依靠這些臨床表現(xiàn)很難與其他導(dǎo)致流產(chǎn)性疫病的感染，如豬偽狂犬病、豬乙型腦炎和豬布魯氏菌病等相區(qū)別。因此，確診必須進(jìn)行實驗室診斷。

2 病原學(xué)診斷

從流產(chǎn)母豬的子宮分泌物或者流產(chǎn)胎兒的腎、肺、睪丸、腦、胎盤和腸系膜淋巴結(jié)等樣品中檢測出有PPV就可以做出陽性診斷。

2.1 病毒的分離鑒定

病毒的分離多采用接種細(xì)胞的方法。PPV只能在來源于豬的細(xì)胞(如豬腎原代細(xì)胞、豬睪丸細(xì)胞，次代豬腎、豬睪丸細(xì)胞及PK-15，CPK，IBRS-2，MVPK，ST等傳代細(xì)胞)和人的某些傳代細(xì)胞(如Hela，KB，Hep-2，Lul32等細(xì)胞)中培養(yǎng)增殖，其中以豬腎原代細(xì)胞較為常用。由于PPV復(fù)制需要細(xì)胞源DNA合成酶，最適宜在具有旺盛增殖能力并處于有絲分裂過程中的細(xì)胞內(nèi)增殖，因此進(jìn)行PPV培養(yǎng)時應(yīng)與細(xì)胞同時接種或在細(xì)胞未形成單層之前接種，這是PPV分離成功與否的關(guān)鍵。

在進(jìn)行PPV分離時通常采取流產(chǎn)胎兒的腎、肺、睪丸、腦、胎盤和腸系膜淋巴結(jié)等病料分離病毒，其中以腸系膜淋巴結(jié)和肝臟的病毒分離率最高。病料按參考文獻(xiàn)[3]剪碎處理后，用PBS制成1∶10的懸液，加入雙抗后研磨，反復(fù)凍融2次，然后超聲波裂解3 min，并經(jīng)2 000 r/min離心后，取上清液與培養(yǎng)細(xì)胞同步接種或者接種于尚未長成單層的豬腎原代細(xì)胞。37 ℃培養(yǎng)，逐日觀察細(xì)胞病變（CPE）。接種了樣品的細(xì)胞于48～96 h后可明顯見到規(guī)律性的CPE：細(xì)胞漿出現(xiàn)彌散性顆粒，病變細(xì)胞變圓，聚集成簇，呈現(xiàn)拉網(wǎng)狀，96～120 h后，這種灶性細(xì)胞病變由疏散狀態(tài)發(fā)展為密布整個培養(yǎng)瓶；144 h以后，病變的細(xì)胞逐漸脫落、上浮。待細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變后，收獲凍存。同時設(shè)不接種病料的細(xì)胞作為對照。如5～6 d后還未出現(xiàn)病變，再盲傳3代，若無病變則棄之。凡是出現(xiàn)CPE的樣品判為陽性，無CPE的為陰性。

2.2 電鏡檢查

—般來講，電鏡法可對病原的檢出做出準(zhǔn)確診斷，通過電鏡可以觀察病毒的結(jié)構(gòu)、形態(tài)特征及立體構(gòu)型等特點。光學(xué)顯微鏡僅限于對病毒包涵體的檢查(病毒細(xì)胞培養(yǎng)物核內(nèi)包涵體—般在接種后16～36 h出現(xiàn))，但陽性檢出率不高。電鏡和免疫電鏡技術(shù)可觀察到感染細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變，可準(zhǔn)確定位細(xì)胞內(nèi)的病毒粒子。A M Field等取流產(chǎn)的水腫胎兒組織作為標(biāo)本進(jìn)行電鏡觀察(新鮮標(biāo)本用免疫電鏡觀察；福爾馬林固定標(biāo)本直接用透射電鏡觀察)，結(jié)果顯示病毒顆粒存在于受感染細(xì)胞的核內(nèi)及胞漿內(nèi)，而且新鮮標(biāo)本比福爾馬林固定標(biāo)本敏感性高。

3 血清學(xué)診斷

3.1 血凝試驗(HA)

在96微孔板中進(jìn)行，自左至右每孔中預(yù)先加入50μL生理鹽水（或者PBS溶液），然后取病毒原液或者收獲液（將出現(xiàn)病變的細(xì)胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融3次，2 000 r/min離心10 min，除去細(xì)胞碎片，收獲病毒液）。自左至右按1∶2、1∶4、l∶2n作倍比稀釋，每孔加入50μL，最后—孔設(shè)為對照。然后每孔再加入50μL的0.5%豚鼠紅細(xì)胞(或者1%雞紅細(xì)胞)，在微型振蕩混合器上振蕩1 min混勻后，置37 ℃溫箱中作用15～30 min，判定結(jié)果，以50%的紅細(xì)胞能發(fā)生凝集判為終點，樣品出現(xiàn)凝集終點的最高稀釋度定為HA滴度。該方法操作簡便，且能進(jìn)行快速、大量的診斷，但靈敏度低、特異性不強(qiáng)，因此只能作為輔助診斷方法。

3.2 血凝抑制試驗

血凝抑制試驗(HI)是基層獸醫(yī)檢測PPV較為常用的方法。取發(fā)病仔豬組織浸出液制備成血凝素，并稀釋成8個血凝單位。取患病初產(chǎn)母豬血清1 mL，注入試管中，后再向試管中加入8個凝集單位的血凝集1 mL，搖勻，然后再向試管中加入1%的雞血細(xì)胞，置37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中30 min，觀察試管中有無凝集現(xiàn)象。以100%抑制凝集的血清最大稀釋度為該血清的滴度，即血清效價。凡是被PPV陽性血清抑制血凝者，該病毒即為PPV。利用HI檢測人工感染PPV的豬，發(fā)現(xiàn)感染后5 d即可以檢測到陽性抗體，12～14 d抗體滴度高達(dá)1 024～4 096，并能持續(xù)多年檢出抗體。待檢血清進(jìn)行HI試驗時需要先進(jìn)行滅活處理，然后再用紅細(xì)胞吸附，以除去血清中的非特異性血凝素，進(jìn)—步用高嶺土吸附以除去或減少血清中非特異性抑制因子。李剛明等應(yīng)用該方法對湖北省7個地區(qū)62個豬場的1 086份血清進(jìn)行檢測，結(jié)果檢出PPV陽性血清726份，陽性率66.85%。除一個山區(qū)豬場未查出陽性豬外，其余61個豬場均不同程度地檢查出PPV陽性抗體，有個別豬場檢出的抗體陽性率甚至達(dá)到了100%。目前，該方法在國內(nèi)外已廣泛應(yīng)用。

3.3 血清中和試驗

血清中和試驗(SN)是最經(jīng)典、傳統(tǒng)的血清學(xué)方法，用于檢測中和抗體。其原理是利用被檢血清的抗體中和PPV，然后根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞的病變情況來計算血清抗體的滴度。JooHS等[3]建立了SN的標(biāo)準(zhǔn)方法，即采用血清稀釋法，同時設(shè)已知陰、陽性血清對照。向經(jīng)過滅活的不同稀釋度的血清管中加入等量的滴度為100 TCID50/0.1 mL的病毒懸液，混勻后放置2 h，取0.2 mL分別加入3～4支SK細(xì)胞系或豬腎繼代細(xì)胞的培養(yǎng)管中，在輕度震蕩下吸附1 h，然后補(bǔ)足維持液，靜止或旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)5～10 d判定結(jié)果。雖然SN的特異性比HI高，但操作復(fù)雜，首先要進(jìn)行病毒感染力的測定，而PPV在低劑量時并不引起細(xì)胞病變，因此限制了該方法的使用。

3.4 乳膠凝集試驗

何啟蓋[4]等將滅活的PPV經(jīng)硫酸銨沉淀、透析濃縮后病毒液致敏乳膠建立了該方法，可用來檢測PPV抗體。乳膠凝集試驗(LAT)主要操作如下，將PPV接種IBRS-2細(xì)胞培養(yǎng)增殖，待出現(xiàn)細(xì)胞病變（CPE）后，反復(fù)凍融細(xì)胞，收集病毒液，然后用甲醛滅活，再用硫酸銨沉淀，透析濃縮。將濃縮的PPV進(jìn)行方陣滴定，選擇致敏乳膠的最佳條件，制成細(xì)小病毒LAT抗原。將該抗原與PPV陽性血清反應(yīng)，可觀察到凝集顆粒，而該抗原與生理鹽水、PBS、豬瘟、豬弓形體病、豬衣原體病、偽狂犬病、口蹄疫等陽性血清反應(yīng)無任何現(xiàn)象，因此可用本法診斷PPV。楊均等用該方法對貴州省4個地區(qū)6個已經(jīng)免疫PPV的規(guī)?；i場進(jìn)行PPV抗體水平檢測，結(jié)果顯示，PPV免疫抗體水平陽性率為77.9%。鄧位喜等運(yùn)用該方法對遵義地區(qū) 7個縣(市)部分規(guī)模養(yǎng)殖場和散養(yǎng)戶隨機(jī)采取271份豬血清進(jìn)行了血清學(xué)檢測，結(jié)果顯示該地區(qū)規(guī)?；B(yǎng)殖場和散養(yǎng)戶的細(xì)小病毒病抗體陽性檢出率分別是5.21%(11/211)和3.33%( 2/60)，且個別縣陽性率達(dá)27.59% (8/29) 。

由于該方法具有簡便、快速、經(jīng)濟(jì)等特點，被稱為“傻瓜技術(shù)”，特別適合于臨床上的現(xiàn)場檢測。應(yīng)用該方法檢測早期的PPV抗體非常有效，因為豬感染PPV后，IgM出現(xiàn)最早，而乳膠可以和 IgM發(fā)生很好的反應(yīng)。

3.5 熒光抗體染色法

該方法可直接鏡檢組織冰凍切片。采取可疑病豬的扁桃體或者母豬產(chǎn)出的死胎、木乃伊胎，然后將各種組織做冰凍切片，用熒光抗體診斷液染色待檢PPV標(biāo)本片，將染色標(biāo)本片置濕盒中，放入37 ℃培養(yǎng)箱作用30 min。取出用PBS液(pH值7.2～7.6)沖洗和漂洗15 min(中間換液1次)，再用去離子水沖洗除鹽，放置標(biāo)本片讓其自然干燥，然后滴加磷酸甘油，蓋上潔凈的蓋玻片，放于熒光顯微鏡下觀察。若發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)有亮綠色熒光顆粒集結(jié)，而對照無現(xiàn)象，則可判定有PPV抗原。此外，該方法也可以快速準(zhǔn)確的檢測出病毒抗原，還可以在病毒培養(yǎng)過程中，對接種病毒的單層細(xì)胞進(jìn)行檢查。熒光抗體染色法較HI敏感度高，是—種特異性強(qiáng)、檢出率高且快速的診斷方法。

3.6 間接免疫熒光技術(shù)

早在1970年Cartwright等就用熒光顯微鏡來檢測細(xì)胞培養(yǎng)物中是否分離到了PPV。董齊等[5]建立了間接免疫熒光診斷技術(shù)以檢測豬細(xì)小病毒抗原。該方法是將豬細(xì)小病毒高免血清和豬胎兒組織中的PPV抗原形成特異性的反應(yīng)，再加兔抗豬IgG熒光抗體，擴(kuò)大抗原抗體反應(yīng)的范圍來提高檢出率。應(yīng)用該技術(shù)，對PPV人工感染豬和母豬流產(chǎn)、死胎的豬胎兒，采集其肝、肺、腎做冰凍切片進(jìn)行PPV抗原的檢查，5 h內(nèi)就可得出檢查結(jié)果。采用該技術(shù)檢測PPV、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）和豬偽狂犬病毒（PRV），只有PPV出現(xiàn)特異性陽性熒光，而其他病毒未發(fā)現(xiàn)特異性熒光。因此該技術(shù)在臨床上應(yīng)用具有特異、敏感、可靠、快速等特點。

3.7 酶聯(lián)免疫吸附試驗

Hohdalsu等建立了豬細(xì)小病毒酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)診斷技術(shù)。1997年姜永厚等[6]建立了ELISA雙抗夾心法，該方法能從胎豬臟器中檢測豬細(xì)小病毒抗原。劉俊輝[7]等采用差速離心、透析、聚乙二醇濃縮純化PPV制備抗原，建立了檢測PPV血清抗體的間接ELISA方法，通過對400多份樣品的分析，結(jié)果表明該方法特異性強(qiáng)，易于操作，適用于現(xiàn)場血清學(xué)檢測、診斷和大規(guī)模的流行病學(xué)調(diào)查。余波等運(yùn)用ELISA方法對貴州省規(guī)?；B(yǎng)豬場和農(nóng)村散養(yǎng)戶共764頭份豬血清樣本（其中已免疫PPV 588頭份，未免疫PPV 176頭份）進(jìn)行了PPV抗體水平檢測。結(jié)果表明，未免疫豬群PPV的血清抗體陽性率為14.20%，而在免疫豬群PPV的血清抗體陽性率為71.94%。2007年李洪超等采用大腸桿菌表達(dá)的豬細(xì)小病毒非結(jié)構(gòu)NS1蛋白為抗原，建立了PPV-NS1-ELISA，能夠很好地區(qū)分PPV野毒感染與滅活疫苗接種病毒，而且敏感性高、特異性強(qiáng)、簡單快速、檢測成本低，是目前細(xì)小病毒感染鑒別診斷的有效方法。實踐證明，ELISA檢測PPV抗體與HI檢測結(jié)果—致，且操作簡便，特異性較高，適用于大規(guī)模的樣品檢測。

3.8 銀加強(qiáng)膠體金技術(shù)

銀加強(qiáng)膠體金技術(shù)(SECGA)是近年來的—種新技術(shù)，SECGA是繼熒光素、同位素、酶標(biāo)技術(shù)之后，又—重要的標(biāo)記技術(shù)，它有其獨特的優(yōu)點，近年來已在各種生物學(xué)研究中廣泛使用。在臨床使用的免疫印跡技術(shù)幾乎都使用其標(biāo)記，同時在流式、電鏡、免疫、分子生物學(xué)以至生物芯片中都可能利用到。我國學(xué)者黃瑜[8]等報道了應(yīng)用SECGA檢測PPV，是免疫金技術(shù)在PPV診斷上的首次應(yīng)用，對純化PPV抗原的最小檢測量為0.312 5 ng/點，其敏感性分別是間接Dot-ELISA和HA試驗的8倍和1 000倍。SECGA和間接Dot-ELISA對77份樣本檢測的陽性率分別為83.1%和80.5%，陽性符合率為96.9% 。20份樣本SECGA的檢測結(jié)果與病毒分離和鑒定結(jié)果完全相符，表明SECGA不僅敏感性高而且特異性好，且SECGA無需特殊儀器設(shè)備，可用光鏡或肉眼觀察結(jié)果，更適于臨床應(yīng)用，經(jīng)濟(jì)、快速、簡便、無污染，適于大批量的抗原樣本的檢測。

3.9 對流免疫電泳

在0.075 mo1/L離子濃度、pH8.6的巴比妥—巴比妥納緩沖液加入1.2%的優(yōu)質(zhì)瓊脂糖，再加入0.01%硫柳汞，水浴充分溶化后傾注成厚1.5 mm的凝膠板，按照常規(guī)瓊擴(kuò)法的操作方法進(jìn)行打孔，孔徑為3 mm，孔間距為6 mm，然后封底、加樣。將加有樣品的瓊脂板放在電泳槽支架上，電泳1～2 h，取下瓊脂板觀察結(jié)果，陽性血清孔應(yīng)與對應(yīng)抗原之間出現(xiàn)清晰的沉淀線，陰性血清孔則無沉淀線。王川慶等利用該技術(shù)檢測PPV抗原和抗體?？乖脱鍩o需特殊處理，在pH8.6、離子濃度為0.1 mol/L、電流4 mA的條件下，1～2 h便可得出結(jié)果。雖然該方法簡單快速，但是與HA或HI相比，其敏感度偏低。

4 分子生物學(xué)診斷

應(yīng)用核酸探針和PCR技術(shù)來診斷PPV極大地提高了診斷的敏感性和特異性，使得微量PPV的污染或感染的檢測成為了可能。

4.1 常規(guī)PCR

PCR方法是一種用于在體外酶促擴(kuò)增特定DNA片段的方法。目前，該方法已廣泛用于豬細(xì)小病毒的檢測。Molitor等對應(yīng)用PCR方法診斷PPV 進(jìn)行了最先報道。根據(jù)NADL-8和NADL-2的堿基序列設(shè)計合成了一對含有20個堿基的特異性引物和寡核苷酸探針，此方法最少可以檢出100 fg的RFDNA，即1PFU的病毒感染量。李文剛等[9]對 PPV DNA結(jié)構(gòu)蛋白VP1編碼區(qū)228 bp片段進(jìn)行了擴(kuò)增，還以另一對引物對VP2編碼區(qū)158 bp的DNA片段進(jìn)行了擴(kuò)增，并用Pvu Ⅱ和EcoR Ⅰ分析確定其特異性，最低可檢出 10 fg的DNA模板。戎偉等[10]對 PPV VP2基因內(nèi)的 158 bp進(jìn)行了擴(kuò)增，經(jīng)EcoRI酶切鑒定，證實了該擴(kuò)增片段的特異性，最低檢出量為0.008病毒血凝單位。

4.2 巢式PCR

巢式PCR是利用2對PCR引物擴(kuò)增目的片段的方法。它利用第1對引物擴(kuò)增15～30個循環(huán)，再用第1次擴(kuò)增的DNA片段內(nèi)設(shè)定的第2對引物擴(kuò)增15～30個循環(huán)。該方法比常規(guī)PCR方法更加特異，并且當(dāng)樣品內(nèi)病原微生物含量極低時，常規(guī)PCR不一定能檢測到，但是套式PCR可以克服該問題，進(jìn)行更加微量的DNA檢測。王漢中等[11]在PPV基因組VP2基因上選擇了2對引物進(jìn)行巢式PCR體外擴(kuò)增，產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳和生物素標(biāo)記的探針鑒定證實具有特異性，同時其敏感性試驗結(jié)果表明巢式PCR能檢測到1 TCID50的病毒量，而一般PCR僅能檢測到100 TCID50的病毒量。這表明套式PCR的靈敏度至少是一般PCR的100倍。引物除選擇在PPV的結(jié)構(gòu)基因區(qū)域外，R M Soares 等在NS-1的保守區(qū)選擇引物，用于檢測感染細(xì)胞系和臨床樣品，實驗結(jié)果表明其敏感性比HA高100倍。Belak等[12]為了評價PPV疫苗的免疫力，對3頭PPV疫苗免疫豬和3頭未免疫豬同時進(jìn)行PPV強(qiáng)毒感染，所生產(chǎn)的胎兒用HA、IF、PCR和巢式PCR檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，免疫豬所產(chǎn)胎兒4種方法檢測均為陰性，而未免疫豬所產(chǎn)胎兒的陽性檢出率為：HA60.8%(14/23)，IF69.5%(16/23)，標(biāo) 準(zhǔn) PCR60%(12/20)， 巢 式PCR82.6%(19/23)。此4種檢測方法的相關(guān)系數(shù)十分接近(r<0.83)。雖然巢式PCR靈敏度更高，特異性更強(qiáng)，但是此項技術(shù)需要昂貴的試劑及熟練的操作人員，極大地限制了其應(yīng)用。

4.3 原位雜交

原位雜交（ISHH）屬于分子雜交的一種，其基本原理是在一定的溫度和離子濃度下，利用已知堿基序列并帶有標(biāo)記物的核酸（如DNA、RNA、cDNA、寡聚核苷酸）作為探針，通過堿基互補(bǔ)規(guī)則與組織細(xì)胞內(nèi)待測的核酸復(fù)性結(jié)合形成雜交體，并通過與探針上標(biāo)記物相應(yīng)的檢測系統(tǒng)，對組織細(xì)胞中待測核酸進(jìn)行定位、定性和相對定量。此方法有很高的敏感性和特異性，可進(jìn)一步從分子水平來探討細(xì)胞的功能表達(dá)及其調(diào)節(jié)機(jī)制，已成為當(dāng)今分子生物學(xué)研究的重要手段。

4.4 核酸探針

核酸探針技術(shù)是一種分子水平的檢測技術(shù)，具有快速、敏感、特異性強(qiáng)等特點，特別適用于疾病的早期診斷和類癥鑒別診斷，是近20年來應(yīng)用較多的一項診斷技術(shù)。Krell等率先將核酸探針技術(shù)用于PPV的診斷，結(jié)果最低可檢出0.1 pg的DNA。A C Forster 等建立了光生物素 N-(4-azido-2-nitrophenyl)-N-(N-d- biotinyl-3-aminopropyl)-N’-methyl-1，3-propanedi-amine標(biāo) 記DNA和RNA的非放射性探針技術(shù)，并與放射性同位素32P標(biāo)記以及其他非放射性標(biāo)記方法進(jìn)行比較，結(jié)果表明，利用生物素標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交，具有快速、可靠、安全和價格低等特點，同時也避免了放射性同位素標(biāo)記的許多缺點。侯喜林等[13]用地高辛對豬細(xì)小病毒標(biāo)記后制備探針，運(yùn)用該探針對多株P(guān)PV病毒及具有相同臨床癥狀的豬瘟病毒、日本乙型腦炎病毒、偽狂犬病病毒等進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，該探針與豬細(xì)小病毒DNA雜交呈陽性反應(yīng)，而與其他病毒反應(yīng)呈陰性，且探針的最低檢出限量為40 pg DNA。這表明該探針特異性強(qiáng)、敏感性高，適用于豬細(xì)小病毒的檢測。Oraveerakul等報道利用非放射性標(biāo)記探針檢測培養(yǎng)細(xì)胞和胎兒組織中 PPV DNA，結(jié)果表明其敏感性比IFA高10～100倍。白紅光等克隆了 PPV YK株保守序列NS1基因，將其純化后，制備了NS1基因PCR產(chǎn)物探針，并用地高辛標(biāo)記，結(jié)果表明，該探針對PPV檢測的敏感性可達(dá)到l pg/μL。核酸探針技術(shù)與HA、SN相比，其特異性和敏感性更高，但該方法的技術(shù)含量高，只能在專業(yè)實驗室應(yīng)用，不適合大面積臨床診斷和現(xiàn)場應(yīng)用。

4.5 實時熒光定量PCR

實時熒光定量PCR是—種在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號的積累實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。該技術(shù)與常規(guī)的PCR相比，不僅實現(xiàn)了對DNA模板的定量，而且具有靈敏性和特異性高，能實現(xiàn)多重反應(yīng)、自動化程度高、無污染、實時和準(zhǔn)確等特點。目前，已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)研究領(lǐng)域，特別是近幾年來在動物疫病病原體的定性和定量方面得到了廣泛應(yīng)用。李明鳳等[14]利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出PPV VP2基因保守區(qū)194 bp片段，并克隆到pGEMT載體上，以l0倍梯度稀釋純化后的質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)模板，進(jìn)行SYBR Green I熒光定量PCR擴(kuò)增并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立了PPV的熒光定量PCR檢測方法。該方法檢測靈敏度可達(dá)1.0×102拷貝/μL，并且與PRRSV、PCV2、JEV、PRV、CSFV和豬流感病毒不發(fā)生交叉反應(yīng)，具有良好的特異性和重復(fù)性。研究人員將SYBR Green I Real-Time PCR與常規(guī)PCR相比，發(fā)現(xiàn)其敏感性提高了100倍。

4.6 環(huán)介導(dǎo)的等溫擴(kuò)增反應(yīng)(LAMP)

LAMP由日本學(xué)者于2000年建立。它利用2～3對引物(包括1對外部引物、1對內(nèi)部引物和1對環(huán)引物)和鏈置換DNA聚合酶，在等溫條件下，幾十分鐘就可擴(kuò)增出靶序列。由于該方法用時短，對設(shè)備要求低，且比普通PCR的敏感性高，非常適合于基層和現(xiàn)場操作使用。目前已有學(xué)者將該技術(shù)運(yùn)用到PPV的檢測中，根據(jù)PPV VP2基因設(shè)計4條引物，利用LAMP在62 ℃的恒溫條件下快速鑒別PPV，其敏感度可以達(dá)到5拷貝數(shù)，并且沒有非特異性擴(kuò)增。利用該法對125份臨床樣品進(jìn)行檢測，PPV檢出率為97.6%，比常規(guī)PCR靈敏度高。劉業(yè)兵等[15]利用LAMP Real Time Turbidimeter LA-320儀 對PPV LAMP過 程 進(jìn) 行 了實時分析，篩選出可靠、最佳的反應(yīng)體系，建立了快速、特異的檢測PPV的LAMP方法，其檢出限量為 0.23 TCID50，具有很高的敏感性。同時，他們在LAMP反應(yīng)結(jié)束后，向反應(yīng)體系中加入SYBR Green I，并將染色后肉眼觀察的結(jié)果與LAMP Real Time Turbidimeter LA-320儀的檢測結(jié)果進(jìn)行對比，結(jié)果一致。該檢測方法具有操作簡單、設(shè)備要求低、快速、特異、靈敏等特點，適合用于臨床上快速檢測PPV。這就為PPV診斷的現(xiàn)場操作和快速診斷奠定了基礎(chǔ)。

4.7 多重PCR鑒別診斷豬流產(chǎn)性疫病

由于豬細(xì)小病毒常與豬瘟病毒、豬偽狂犬病病毒等呈混合感染。若采用常規(guī)的診斷方法如病毒的分離鑒定及血清學(xué)方法對這3種病進(jìn)行診斷，費時費力。因此已經(jīng)有研究學(xué)者建立了可以同時診斷多種疫病的多重PCR診斷方法。該方法是在同一PCR體系中，同時加入多對引物，實現(xiàn)了對多種目的基因同時擴(kuò)增。該診斷方法具有快速、敏感、特異、省時省力等優(yōu)點。余麗蕓等[16]建立了檢測CSFV、PPV、PRV的多重PCR診斷方法，該方法可以檢測 到14.5 ng/L的CSFV，27.1 ng/L的PPV及31.4 ng/L PRV的核酸模板，特異性很高。

綜上所述，用于PPV感染的診斷方法很多，各種方法具有不同的優(yōu)缺點，相對而言，目前應(yīng)用較多的是HA和HI試驗，這2種方法基本能滿足常規(guī)的病原檢測和血清流行病學(xué)調(diào)查等需要。要得到病原學(xué)的確診，則最好利用病毒分離鑒定方法，其他血清學(xué)診斷方法則根據(jù)不同的實驗室條件和情況選擇應(yīng)用。而核酸探針和PCR等分子生物學(xué)診斷方法由于其靈敏度高、特異性好，在實驗室的應(yīng)用越來越廣。隨著PPV的研究不斷深入，分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，一定會有更加靈敏、更加準(zhǔn)確、操作更加簡便的PPV診斷技術(shù)不斷地出現(xiàn)和應(yīng)用。

[1] 殷震,劉景華.動物病毒學(xué)[M].第2版.北 京:科 學(xué) 出 版 社,1997:1150-1154.

[2] Cartwright S F.A small haemagglutinating porcine DNA virus I Isolation and properties[J].J Path，1969， 79:371-377.

[3] Joo H S, Donaldson Wood C R,Johnson R H.A microneutralization test for the assay of porcine parvovirus antibody[J]. Arch Virol,1975,47(4): 337-341.

[4] 何啟蓋，陳煥春，吳斌，等.檢測豬細(xì)小病毒血清抗體乳膠凝集試驗方法的建立及初步應(yīng)用[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報,1999,2l(6):457-459.

[5] 董齊，韓孝成，王潤芝.應(yīng)用間接免疫熒光技術(shù)快速檢測豬細(xì)小病毒抗原[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報,1999(1):56-59.

[6] 姜永厚，孫宗禹，劉文周，等.應(yīng)用ELISA雙抗體夾心法檢測豬細(xì)小病毒抗原的研究[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，1997 (4):1-3.

[7] 劉俊輝，郭福生，龔振華，等.用ELISA檢測豬細(xì)小病毒(PPV)血清抗體[J].中國動物檢疫，2004，26(2):26-27.

[8] 黃瑜，甘孟侯，劉尚高.銀加強(qiáng)膠體金技術(shù)檢測豬細(xì)小病毒的研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報，1995，26(3):239-244.

[9] 李文剛，甘孟侯.聚合酶鏈反應(yīng)檢測豬細(xì)小病毒的研究[J].中國獸醫(yī)雜志，1996，22(8):3-5.

[10] 戎偉，楊潤德.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測豬細(xì)小病毒方法的研究[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2004，26(6): 465-467.

[11] 王漢中,梁莉.應(yīng)用巢式PCR檢測豬細(xì)小病毒[J].病毒學(xué)報,1996,12(2):177-181.

[12] Belak S, Rivera E, Ballagi-Pordany A, et al. Detection of challenge virus in fetal tissues by nested PCR as a test of the potency of a porcine parvovirus vaccine [J].Vet Res Commun, 1998, 22(2):139-146.

[13] 侯喜林,甘孟侯,余麗蕓.豬細(xì)小病毒分離、核酸探針研制及應(yīng)用[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報,1998(5):625-637.

[14] 李明鳳，魏戰(zhàn)勇，王學(xué)斌，等.豬細(xì)小病毒SYBR Green I實時定量PCR檢測方法的建立[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報,2009,2l(3):220-224.

[15] 劉業(yè)兵，張磊，寧宜寶，等.豬細(xì)小病毒LAMP檢測方法的建立[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,43(14):3012-3018.

[16] 余麗蕓，劉建柱，侯喜林，等.多重PCR檢測豬瘟病毒、豬細(xì)小病毒和豬偽狂犬病病毒的研究[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2004，25(6):75-77.