馮金梅, 孫 雋, 文建凡

(中國科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所 遺傳資源與進(jìn)化國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650223)

核仁(nucleolus)是普遍存在于真核細(xì)胞間期核中最顯著的結(jié)構(gòu)。20世紀(jì)60年代人們就已認(rèn)識(shí)到核仁的主要功能是作為真核細(xì)胞rDNA轉(zhuǎn)錄、加工和核糖體大、小亞基組裝的場所。rRNA在核仁中被轉(zhuǎn)錄、加工并與其他一些蛋白和小分子組裝成核糖體大、小亞基, 然后輸出細(xì)胞核, 在細(xì)胞質(zhì)中裝配成完整的核糖體以執(zhí)行蛋白質(zhì)合成功能, 因此核仁被稱為“核糖體加工工廠”(Warner, 1990)。然而,近年來的一系列研究提示核仁還具有其他一些與核糖體生物合成并不直接相關(guān)的功能, 如信號(hào)識(shí)別顆粒(SRP)的組裝、mRNA的產(chǎn)生和運(yùn)輸、小RNA分子修飾、RNA編輯、端粒的成熟、細(xì)胞周期調(diào)控和感受細(xì)胞脅迫等(Olson et al, 2002; Boisvert et al,2007; Brown & Shaw, 2008; Shaw & Brown, 2012)。特別是近年來不斷進(jìn)步的核仁分離技術(shù)以及高通量質(zhì)譜鑒定和分析核仁蛋白技術(shù)的不斷發(fā)展, 已獲得多個(gè)物種的核仁蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù) (Huh et al, 2003;Pendle et al, 2005; Ahmad et al, 2009), 導(dǎo)致人們對(duì)核仁的組成與功能有了新的認(rèn)識(shí), 同時(shí)也為從“組學(xué)”水平研究核仁的起源與進(jìn)化奠定了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)?？傊? 從發(fā)現(xiàn)核仁的主要功能為核糖體生物合成至今的近半個(gè)世紀(jì)以來, 有關(guān)核仁的研究取得了很大進(jìn)展, 本文概述了近年來在核仁結(jié)構(gòu)、功能、蛋白質(zhì)組學(xué)分析及其起源與進(jìn)化等方面的進(jìn)展。

1 核仁結(jié)構(gòu)

核仁是細(xì)胞核內(nèi)由緊密組織在rRNA基因周圍的一些蛋白和小分子 RNA組成的結(jié)構(gòu), 且不被膜包裹。通過電鏡超薄切片觀察可見高等動(dòng)物的典型核仁由三個(gè)特征性區(qū)域組成：纖維中心(fibrillar centres, FC)是包埋在顆粒組分內(nèi)部的淺染低電子密度區(qū)域, 大小在0.1～1.0 μm; 包圍著FC的致密纖維組分(dense fibrillar component, DFC)是核仁超微結(jié)構(gòu)中電子密度最高的部分; 顆粒組分(granular component, GC)是代謝活躍的細(xì)胞核仁的主要結(jié)構(gòu),由直徑15～20 nm的顆粒組成。

盡管人們以前一直試圖將核仁的超微結(jié)構(gòu)簡化為上述三個(gè)特征性區(qū)域, 但新的研究表明實(shí)際上動(dòng)、植物細(xì)胞的核仁存在顯著差異(Shaw & Brown,2012)。在高等動(dòng)物典型核仁中, GC、DFC和FC的體積分別為 75%、17%和 2%。高等植物細(xì)胞核仁的DFC多達(dá)70%, 而FC僅為～1%, DFC染色并不比GC染色深, 且植物細(xì)胞核仁中普遍具有核仁腔。

隨著研究的深入, 人們發(fā)現(xiàn)并不是所有細(xì)胞的核仁都具有以上三個(gè)特征性區(qū)域。例如, 除羊膜動(dòng)物的細(xì)胞核仁具有三個(gè)特征性區(qū)域外, 其他真核生物的核仁均僅具有兩個(gè)特征性區(qū)域(不具有FC)(Thiry & Lafontaine, 2005)。對(duì)單細(xì)胞原生生物賈第蟲的研究也顯示后一種情況：雖然前人的研究認(rèn)為賈第蟲不具有核仁結(jié)構(gòu)（Li et al, 1997; Xin et al,2005), 但近來的研究表明其不僅具有核仁結(jié)構(gòu), 且其核仁僅具有 DFC和 GC而缺乏 FC (Jimenez-Garcia et al, 2008)。然而, 也有研究不支持以上觀點(diǎn),例如無羊膜兩棲類動(dòng)物的細(xì)胞核仁中確實(shí)存在 FC組分（Handwerger et al, 2005)。

實(shí)際上, 核仁結(jié)構(gòu)可能與細(xì)胞內(nèi)核糖體生物合成的速率相關(guān)。通常, 當(dāng)細(xì)胞內(nèi)核糖體生物合成的速率很高時(shí), 核仁具有多個(gè)FC, 而當(dāng)細(xì)胞代謝和轉(zhuǎn)錄活性很低時(shí), 細(xì)胞核仁僅具有一個(gè)FC。例如, 人休眠的淋巴細(xì)胞核仁僅具有一個(gè)包含單個(gè)FC組分的小核仁(Hozak et al, 1994); 而快速生長的哺乳動(dòng)物的體細(xì)胞常常有多個(gè)大核仁, 且每個(gè)核仁都有許多FC (Koberna et al, 2002); 有意思的是, 具有高度活性的老鼠神經(jīng)元細(xì)胞核仁同時(shí)具有一個(gè)巨大的FC(GFC)和多個(gè)FC組分(Casafont et al, 2007)。

以上研究表明僅用三個(gè)特征性區(qū)域來概括核仁結(jié)構(gòu)可能過于簡單。人們?cè)?jīng)認(rèn)為GC中的顆粒完全是核糖體生物合成過程中多個(gè)不同階段加工產(chǎn)生的前核糖體顆粒, 但近來的研究表明一些其他類型的復(fù)合體可能占據(jù)了 GC中的特定區(qū)域(Politz et al, 2005)。另外, 對(duì) DFC特異的核仁標(biāo)記蛋白fibrillarin在轉(zhuǎn)錄過程中雖然與rRNA基因緊密相連,在復(fù)制過程中卻并不與rRNA基因定位在一起, 這提示DFC存在功能上的異質(zhì)性(Pliss et al, 2005)。這些現(xiàn)象均表明核仁結(jié)構(gòu)可能遠(yuǎn)比我們目前的認(rèn)識(shí)復(fù)雜。

2 核仁功能

很早已有研究表明核仁可能具有除核糖體生物合成以外的功能。如20世紀(jì)60年代末, Hela細(xì)胞與雞紅細(xì)胞的融合實(shí)驗(yàn)就表明核仁對(duì)于特定

mRNA的表達(dá)是必需的(Harris, 1967)。近年來, 越來越多的研究表明許多與核糖體生物合成不相關(guān)的蛋白及一些功能未知的蛋白也定位于核仁中, 提示核仁可能還具有許多除核糖體生物合成以外的功能。具體如下：

2.1 參與除rRNA以外的其他RNA的代謝

2.1.1 mRNA的產(chǎn)生和運(yùn)輸 在早期證明核仁可能與特定mRNA的產(chǎn)生相關(guān)后, 越來越多的研究結(jié)果支持這一觀點(diǎn)。如哺乳動(dòng)物c-Myc蛋白的mRNA定位于核仁內(nèi)（Bond & Wold, 1993); 酵母中大量參與拼接過程的snRNAs定位于核仁（Potashkin et al,1990); 酵母核仁形態(tài)的異常與 mRNA產(chǎn)生和運(yùn)輸?shù)漠惓Ｏ嚓P(guān), 而mRNA產(chǎn)生和運(yùn)輸異常的酵母突變株核仁中富集有poly(A)+RNA (Schneiter et al, 1995;Tani et al, 1995); 特別是植物的外顯子連接復(fù)合體(exon junction complex, EJC)蛋白與核仁結(jié)合(Pendle et al, 2005), 植物的多個(gè)mRNA轉(zhuǎn)錄本聚集于核仁（Kim et al, 2009)。此外, 核仁還協(xié)助病毒mRNA的運(yùn)輸, 例如, 兩個(gè)與mRNA運(yùn)輸相關(guān)的人類反轉(zhuǎn)錄病毒蛋白, HTLV-I的Rex蛋白和HIV的Rev蛋白, 都具有顯著的核仁定位現(xiàn)象（Siomi et al,1988; Kubota et al, 1989; Michienzi et al, 2000)。

2.1.2 RNA編輯 ADAR1和ADAR2是哺乳動(dòng)物中最常見的RNA編輯酶, 它們將長的dsRNA分子或特定mRNA上的腺嘌呤核苷脫氨基為次黃嘌呤,這兩個(gè)酶均具有一個(gè)核仁時(shí)期（Desterro et al, 2003;Nie et al, 2004; Sallacz & Jantsch, 2005)。人類細(xì)胞谷氨酸鹽受體(GluR-B)是這類酶的底物, 在表達(dá)該底物的RNA 時(shí), ADAR1和ADAR2離開核仁并結(jié)合到核質(zhì)中包含 GluR-B 前體 RNA的位點(diǎn)上。ADAR2介導(dǎo)的 RNA編輯過程發(fā)生在核仁, 且ADAR2富集于核仁內(nèi)一個(gè)新的亞區(qū)域, 該區(qū)域明顯不同于FC、DFC和GC (Vitali et al, 2005)。

2.1.3 tRNA的成熟 原位雜交實(shí)驗(yàn)表明酵母的pre-tRNA存在于核仁中(Bertrand et al, 1998)。此外,參與催化pre-tRNA 5'剪切的RNase P的所用蛋白和RNA組分, 以及催化 pre-tRNA 假尿嘧啶化的Cbf5p/Dyskerin 蛋白都定位于核仁(Jacobson et al,1997; Jarrous et al, 1999)。

酵母核輸出的tRNA均為氨?；痶RNA, 而氨酰突變?nèi)笔У慕湍钢?tRNA富集于核仁, 表明 tRNA氨?；倪^程發(fā)生于核仁(Steiner-Mosonyi &Mangroo, 2004)。通常, 很多酵母tRNA基因定位于核仁或其周圍, 但當(dāng)Pol III多聚酶突變或tRNA啟動(dòng)子無功能化時(shí), 這種定位情況將會(huì)減少或消失(Thompson et al, 2003)。另外, 當(dāng)酵母Pol II轉(zhuǎn)錄基因與tRNA基因鄰近時(shí), Pol II 轉(zhuǎn)錄基因?qū)⒈怀聊?。有假說認(rèn)為核仁將鄰近tRNA的Pol II轉(zhuǎn)錄基因扣留, 使得Pol II轉(zhuǎn)錄基因進(jìn)入缺乏相關(guān)多聚酶亞基的核區(qū)域, 因此, 這種沉默可能由大量分散的tRNA聚集于核仁所導(dǎo)致(Wang et al, 2005)。

2.1.4 SRP的組裝 SRP (signal recognition particle)是由 RNA和一些蛋白組裝形成的復(fù)合體。研究表明至少 SRP組裝的部分步驟是在核仁中發(fā)生的。Jacobson & Pederson（1998)將SRP RNA注射入培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中, 發(fā)現(xiàn) SRP RNA快速定位于核仁, 然后逐漸重定位于細(xì)胞質(zhì), 這一結(jié)果提示SRP可能在核仁中組裝后被輸出。原位雜交和生化分離等實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了 SRP RNA的這種定位情形(Politz et al, 2000; Sommerville et al, 2005)。此外, 脊椎動(dòng)物和酵母的成熟胞質(zhì) SRP的大部分蛋白組分(除SRP54外的SRP19、SRP68和SRP72)均定位于核仁(Politz et al, 2000; Grosshans et al, 2001)。這些研究均表明SRP組裝的核仁時(shí)期。

2.1.5 核內(nèi)小RNA(snRNA)和核仁小RNA(snoRNA)的加工與成熟 snRNA通過形成拼接復(fù)合體的核心來參與拼接過程, snoRNA參與核糖體的生物合成。snRNA和snoRNA本身都含有修飾堿基, 其修飾由存在于核仁附屬結(jié)構(gòu)——卷曲體內(nèi)的 snRNAs指導(dǎo), 表明部分 snRNA的成熟發(fā)生于卷曲體中(Jady et al, 2003; Liu et al, 2006)。植物的許多snoRNA以多順反子的前體形式被轉(zhuǎn)錄, 原位雜交實(shí)驗(yàn)顯示這些pre-snoRNA存在于卷曲體和核仁內(nèi),表明植物 snoRNA的加工發(fā)生于卷曲體和核仁中(Shaw et al, 1998)。近年來多個(gè)物種的核仁蛋白質(zhì)組學(xué)研究強(qiáng)烈支持許多snRNPs（特別是SM類蛋白)具有一個(gè)核仁時(shí)期（Huh et al, 2003; Pendle et al,2005; Ahmad et al, 2009)。此外, 研究表明U4/U6.U5和 U2存在于核仁, 它們成熟和組裝的部分過程發(fā)生于核仁（Yu et al, 2001; Gerbi & Lange, 2002)。更有意思的是, 克隆和測序擬南芥核仁的 RNA揭示其核仁中具有多個(gè)snRNAs和snoRNAs (Kim et al,2010)。這些研究表明核仁在 snRNA的成熟和snRNP的組裝過程中具有重要作用。

2.1.6 異染色質(zhì)siRNA途徑 異染色質(zhì)siRNA是在植物中發(fā)現(xiàn)的, 它是由RNA聚合酶IV(Pol IV)催化著絲粒重復(fù)區(qū)域DNA的兩條鏈均發(fā)生轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的 snRNA。它的產(chǎn)生需要 Pol IV的大亞基(NRPD1b)、AGO3、DCL3和RDR2等蛋白組分參與, 這些蛋白都與siRNA共定位于核仁（Li et al,2006; Pontes et al, 2006)。因此, siRNA的產(chǎn)生和沉默復(fù)合體的組裝等過程可能發(fā)生于核仁。

2.2 調(diào)控細(xì)胞功能

2.2.1 蛋白質(zhì)翻譯 20世紀(jì) 60年代, 有研究表明豌豆核仁中有蛋白質(zhì)翻譯過程的發(fā)生(Birnstiel &Hyde, 1963), 但在確切證明蛋白質(zhì)翻譯發(fā)生于細(xì)胞質(zhì)后, 這一結(jié)果被認(rèn)為由細(xì)胞質(zhì)污染所致。后來,Iborra et al（2001)通過標(biāo)記人類HeLa細(xì)胞的氨酰tRNA, 孵育培養(yǎng)后用熒光顯微鏡檢測新生標(biāo)記蛋白的定位情況, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)有 9%～15%的新生標(biāo)記蛋白定位于核仁; 然而, Nathanson et al（2003)重復(fù)該實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)至多只有 1%新生標(biāo)記蛋白定位于核仁, 推測核仁中檢測到的新生標(biāo)記蛋白可能來源于細(xì)胞質(zhì)污染。但是, 已有的核仁蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)表明大量的轉(zhuǎn)錄起始因子和延伸因子等蛋白質(zhì)翻譯因子存在于動(dòng)、植物的核仁中（Huh et al, 2003; Pendle et al, 2005; Ahmad et al, 2009)。因此, 蛋白質(zhì)翻譯是否發(fā)生于細(xì)胞核仁仍存在爭議。

2.2.2 細(xì)胞周期調(diào)控 核仁可能通過滯留細(xì)胞周期調(diào)節(jié)物來調(diào)控細(xì)胞周期。研究較為清楚的三個(gè)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)物是Cdc14p、Mdm2和Pch2 (Visintin &Amon, 2000)。Cdc14p是一個(gè)蛋白磷酸酶, 在促進(jìn)酵母細(xì)胞退出有絲分裂過程中具重要作用, 在有絲分裂末期之前的所有時(shí)期, 它以失活狀態(tài)滯留在核仁中, 直到有絲分裂末期才從核仁釋放到細(xì)胞核質(zhì)中, 磷酸化CDK, 從而起始有絲分裂過程的退出。Mdm2是哺乳動(dòng)物腫瘤抑癌蛋白p53的抑制子, 通過調(diào)節(jié)p53的活性調(diào)控G1/G2期檢驗(yàn)點(diǎn)。當(dāng)原癌基因Myc具有活性時(shí), Mdm2被p19ARF滯留在核仁中,以使p53具有活性; 當(dāng)核仁中Mdm2的濃度較高時(shí),p19ARF重定位于細(xì)胞質(zhì)中, 從而釋放Mdm2到細(xì)胞核。Pch2定位于酵母和哺乳動(dòng)物核仁, 當(dāng)同源重組和染色體聯(lián)會(huì)發(fā)生錯(cuò)誤時(shí), Pch2將富集于核仁, 激活粗線期檢驗(yàn)點(diǎn), 阻止減數(shù)分裂細(xì)胞周期過程。

2.2.3 細(xì)胞脅迫傳感器 當(dāng)細(xì)胞受到UV照射、熱休克和缺氧等刺激時(shí), 細(xì)胞核仁解聚, 核仁蛋白釋放到核質(zhì)中。Rubbi & Milner（2003)報(bào)道核仁主要通過一些核仁蛋白調(diào)控p53的功能實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的應(yīng)激反應(yīng)?？勺冮喿x框蛋白（alternative reading frame,ARF)是最常見的調(diào)控p53功能的核仁蛋白。當(dāng)細(xì)胞在靜息狀態(tài)時(shí), p53通過與其泛素連接酶MDM2相互作用, 不斷地被泛素化標(biāo)記, 并被轉(zhuǎn)位到胞質(zhì)中被蛋白酶體系統(tǒng)降解, 從而保持低水平的 p53蛋白。當(dāng)細(xì)胞處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí), 核仁蛋白ARF被釋放到核質(zhì)中與 p53競爭性結(jié)合 MDM2, 并將 MDM2帶回核仁, 阻斷p53和MDM2的相互作用, p53得以穩(wěn)定并啟動(dòng)下游基因轉(zhuǎn)錄, 抑制細(xì)胞周期, 促進(jìn)細(xì)胞 DNA損傷修復(fù)或介導(dǎo)細(xì)胞衰老和凋亡, 從而對(duì)外界刺激做出反應(yīng)（Boulon et al, 2010)。另外, 兩種核仁蛋白, B23和核仁素（nucleolin), 在脅迫條件下可與p53蛋白直接或間接結(jié)合, 從而對(duì)外界刺激做出反應(yīng)（Grisendi et al, 2005)。此外, 最近的研究揭示核仁在對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞感受外界脅迫的應(yīng)答過程中起著重要作用（Hetman & Pietrzak, 2012)。

2.2.4 細(xì)胞衰老 酵母Sir4基因突變體的壽命延長(Guarente, 1997) 是最早提示核仁與細(xì)胞衰老可能相關(guān)的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象。在該突變體中, 延長酵母壽命的蛋白UTH4, 可介導(dǎo)沉默的Sir3蛋白和Sir4蛋白從端粒移位到核仁, 正是這種重新定位促使細(xì)胞壽命延長（Kennedy et al, 1995)。此外, 研究還發(fā)現(xiàn)核仁蛋白SIR1和FOB1影響酵母細(xì)胞的年齡, sir1的突變使酵母發(fā)生早熟現(xiàn)象, 而fob1的突變使酵母細(xì)胞的壽命延長（Kobayashi, 2008)。

眾所周知, 端粒與細(xì)胞的衰老密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)端粒酶 RNA具有能夠使其定位于核仁的H/ACA結(jié)構(gòu)域（Jady et al, 2004)。人端粒酶的反轉(zhuǎn)錄催化亞基（hTERT)具有核仁定位信號(hào), 它的RNA和反轉(zhuǎn)錄酶組分均定位并組裝于核仁（Etheridge et al, 2002)。越來越多的研究表明端粒酶相關(guān)組分存在于核仁, 例如, 擬南芥中發(fā)現(xiàn) dyskerin的同源物定位于核仁 (Kannan et al, 2008); 惡性瘧原蟲中pfTERT定位于與核仁相關(guān)聯(lián)的核組分中(Figueiredo et al, 2005); 此外, 端粒重復(fù)結(jié)合因子(TRF2)以一種細(xì)胞周期特異性的方式定位于核仁(Zhang et al, 2004)。

有意思的是, Kobayashi（2008)提出了細(xì)胞衰老的“rDNA theory”來解釋核仁與細(xì)胞衰老的關(guān)系, 即細(xì)胞的衰老途徑是由rDNA的不穩(wěn)定驅(qū)動(dòng)的。rDNA的不穩(wěn)定性將導(dǎo)致核仁的無功能化, 促進(jìn)細(xì)胞的衰老和最終的死亡, 這提示rDNA和核仁除了參與核糖體生物合成外, 還在細(xì)胞的衰老和死亡中發(fā)揮重要作用。

3 核仁蛋白質(zhì)組學(xué)

隨著核仁分離技術(shù)的不斷改進(jìn), 以及基于蛋白的分離純化和高通量質(zhì)譜分析的蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)的不斷成熟, 核仁蛋白質(zhì)組學(xué)分析近年來迅猛發(fā)展, 這為解答核仁研究中遇到的一系列難題奠定了數(shù)據(jù)基礎(chǔ)并提供了良好的研究視角。

人核仁蛋白質(zhì)組是首個(gè)被測定, 也是目前研究最為深入的核仁蛋白質(zhì)組。早在 2002年, 英國的Lamond和丹麥的Manm領(lǐng)導(dǎo)的研究小組首次報(bào)道了人核仁蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果（Andersen et al,2002)。他們分離了人 Hela細(xì)胞的核仁, 用常用的蛋白分離技術(shù)分離蛋白, 并對(duì)這些蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析, 共鑒定了271個(gè)人核仁蛋白, 而其中僅有10%是原先已知的核仁定位蛋白。同年, Scherl et al也對(duì)人 Hela細(xì)胞進(jìn)行了核仁的分離和蛋白質(zhì)組的分析,鑒定出213個(gè)人核仁蛋白（2002)。后者還對(duì)這兩個(gè)完全沒有交流的結(jié)果進(jìn)行了比較, 發(fā)現(xiàn)133個(gè)蛋白是兩個(gè)研究共有的, 134個(gè)蛋白是前者所獨(dú)自報(bào)道的, 80個(gè)是后者所獨(dú)自報(bào)道的, 兩者在人Hela細(xì)胞中共發(fā)現(xiàn)了近350個(gè)人核仁蛋白。對(duì)所述的核仁蛋白進(jìn)行功能分類, 結(jié)果同預(yù)期一致, 大多數(shù)核仁蛋白均為核糖體蛋白（15.5%)或者與核糖體生物學(xué)發(fā)生相關(guān)的蛋白（23.5%), 其他還有一些與核仁形成相關(guān)的蛋白, 如纖維蛋白和染色體結(jié)構(gòu)蛋白等(Jung et al, 2000; Bergquist et al, 2001)。2005 年,Andersen et al（2005)又在人的核仁中鑒定到更多的核仁蛋白, 從而將人核仁蛋白的數(shù)目增加到725個(gè),且建立了人核仁蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫 Nucleolar Proteome Database （NOPdb 2.0)。這725個(gè)人核仁蛋白中的絕大部分蛋白的功能均已知, 它們大部分是核糖體蛋白與rRNA加工及修飾相關(guān)的蛋白。后來, Lamond的研究小組結(jié)合多種質(zhì)譜分析方法從人的多種細(xì)胞系細(xì)胞核仁中鑒定出4 749個(gè)人核仁蛋白, 并將NOPdb2.0升級(jí)到NOPdb3.0, 該庫中包含了 80%的核糖體蛋白, 而 NOPdb2.0中僅包含28%的核糖體蛋白, 因此 NOPdb3.0中包含了至少80%的人核仁蛋白（Ahmad et al, 2009)。

動(dòng)、植物核仁結(jié)構(gòu)存在很大差別（Shaw et al,1995), 那么動(dòng)、植物核仁蛋白質(zhì)組是否也存在顯著差異呢？2005年, Pendle et al（2005)用蛋白質(zhì)組學(xué)方法分析了首個(gè)植物的核仁蛋白質(zhì)組。他們用與分析人核仁蛋白質(zhì)組相同的方法分析了擬南芥(Arabidopsis thaliana)核仁蛋白質(zhì)組, 共鑒定得到217個(gè)核仁蛋白。對(duì)這些蛋白進(jìn)行功能分析并將它們與人核仁蛋白質(zhì)組進(jìn)行比較, 結(jié)果表明擬南芥核仁蛋白質(zhì)組與人核仁蛋白質(zhì)組一樣除包括很多核糖體合成相關(guān)蛋白外, 還包含諸多其他的蛋白。擬南芥核仁蛋白質(zhì)組中存在一些植物特有的核仁蛋白, 同時(shí)擬南芥核仁中還存在6個(gè)參與mRNA輸出和mRNA監(jiān)視 (mRNA surveillance) 的蛋白, 而這些蛋白在人中并不定位于核仁（Custódio et al,2004)。這些結(jié)果均表明了動(dòng)、植物核仁在結(jié)構(gòu)、成分甚至功能的上差異。

啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)是第一個(gè)基因組被完全測序的真核生物, 它的蛋白功能已研究得較為清楚。結(jié)合酵母所有蛋白的高通量綠色熒光蛋白標(biāo)記的定位分析和一些酵母蛋白的功能研究分析表明酵母細(xì)胞至少具有 209個(gè)核仁蛋白（Huh et al, 2003)。這些蛋白除很多與核糖體合成相關(guān)的蛋白外還包括諸多參與 RNA加工的蛋白、調(diào)節(jié)rRNA各方面代謝的蛋白激酶和磷酸化酶以及一些轉(zhuǎn)錄因子蛋白等。

對(duì)以上這些代表物種核仁蛋白質(zhì)組的分析進(jìn)一步表明核仁確實(shí)具有除參與核糖體生物合成以外的蛋白成分, 提示核仁可能還具有其他功能, 且不同物種之間核仁的功能可能存在差異。這些對(duì)進(jìn)一步深入研究核仁的功能具有重要的啟示作用。

4 核仁起源與進(jìn)化

核仁是真核細(xì)胞中高度保守的亞核結(jié)構(gòu), 其主要功能是參與核糖體的生物合成。原核細(xì)胞中同樣存在核糖體的生物合成過程, 但是原核細(xì)胞不具有核仁結(jié)構(gòu)。那么, 在原核細(xì)胞到真核細(xì)胞的進(jìn)化過程中, 核仁是如何起源與進(jìn)化的呢？前人的研究采用了細(xì)胞學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)等方法來探討核仁的起源與進(jìn)化問題（Li et al, 1997; Li, 1999;Guo et al, 2005), 然而遺憾的是, 這些研究對(duì)回答該問題未能取得突破性的進(jìn)展。但近些年來快速增加的基因/蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)為研究核仁的起源與進(jìn)化提供了新的視角, 使得在“組學(xué)”水平研究核仁的起源與進(jìn)化成為可能。

Staub et al（2004)以271個(gè)人核仁蛋白為研究基礎(chǔ), 共確定了115個(gè)功能已知和91個(gè)功能未知的保守的核仁蛋白的結(jié)構(gòu)域, 并用它們?yōu)閝ueries搜索原核生物的基因組, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)在這206個(gè)保守的核仁蛋白結(jié)構(gòu)域中, 59個(gè)結(jié)構(gòu)域在生物三界（細(xì)菌、古菌及真核生物)中均存在, 25個(gè)僅存在于古菌和真核生物中, 13個(gè)僅存在于細(xì)菌和真核生物中, 其余的109個(gè)為真核生物特有。對(duì)這些核仁蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行功能分析發(fā)現(xiàn)：59個(gè)三界共享和25個(gè)古菌和真核生物共享的蛋白結(jié)構(gòu)域主要為核糖體蛋白結(jié)構(gòu)域以及與RNA修飾和結(jié)合相關(guān)的蛋白結(jié)構(gòu)域;13個(gè)細(xì)菌和真核生物共享的結(jié)構(gòu)域可能是執(zhí)行相對(duì)較新功能的蛋白結(jié)構(gòu)域; 真核生物特有的結(jié)構(gòu)域是與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和DNA緊密性調(diào)節(jié)相關(guān)的結(jié)構(gòu)域?；谝陨辖Y(jié)果, 他們提出參與核糖體生物合成這一主要核仁功能的蛋白起源于古菌, 隨后在核仁進(jìn)化的各個(gè)階段, 參與各種不同功能的蛋白逐漸被招募到核仁中, 從而逐步形成了核仁結(jié)構(gòu)。因此, Staub et al（2006)提出了核仁的“嵌合”起源和“漸進(jìn)式”進(jìn)化假說。2006年, 他們進(jìn)一步對(duì)酵母中與核仁和核糖體組分相關(guān)的蛋白進(jìn)行了起源分析, 發(fā)現(xiàn)與核仁和核糖體組分相關(guān)的核心蛋白為古菌來源, 它們參與核糖體的成熟與組裝過程; 極少的蛋白為細(xì)菌起源; 絕大部分的蛋白均為真核細(xì)胞階段起源。他們推測, 核仁進(jìn)化自一個(gè)古菌來源的核糖體成熟“機(jī)器”, 然后通過不斷招募一些細(xì)菌來源和大部分真核特有的核仁蛋白而逐漸形成核仁結(jié)構(gòu)。因此, 通過分析酵母中與核仁和核糖體組分相關(guān)蛋白的起源進(jìn)一步證實(shí)了核仁的“嵌合”起源假說。

Thiry & Lafontaine（2005)的一系列研究從核仁結(jié)構(gòu)進(jìn)化的角度來探討了核仁在真核生物中的進(jìn)化。他們發(fā)現(xiàn)除羊膜動(dòng)物的核仁具有三個(gè)特征性區(qū)域外（三區(qū)室), 其他所有真核生物的核仁都只具有兩個(gè)特征性區(qū)域（二區(qū)室)。通過比較分析不同物種的 rDNA轉(zhuǎn)錄單位和間隔區(qū)的長度, 發(fā)現(xiàn)具有“二區(qū)室”核仁的物種中rDNA間隔區(qū)常常比rDNA轉(zhuǎn)錄本的長度短或者近似, 而在那些具有“三區(qū)室”核仁的物種中rDNA間隔區(qū)的長度遠(yuǎn)比rDNA轉(zhuǎn)錄本的長度要長。rDNA間隔區(qū)長度的增加可能導(dǎo)致核仁由二區(qū)室（DFC和GC)進(jìn)化為三區(qū)室（FC、GC和 DFC)。間隔區(qū)長度的增加為新區(qū)室的生成提供了空間位置, 從而使得FC和DFC分離, 而rDNA基因本身的長度似乎并沒有在新區(qū)室的形成中起任何作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)羊膜動(dòng)物中僅最原始的羊膜動(dòng)物爬行綱龜目的核仁是“二區(qū)室”的, 而其他羊膜動(dòng)物的核仁均為“三區(qū)室”, 因此, 核仁由“二區(qū)室”進(jìn)化為“三區(qū)室”的過程正好與羊膜動(dòng)物在爬行綱中的出現(xiàn)相吻合（Lamaye et al, 2011; Thiry et al,2011), 提示核仁結(jié)構(gòu)的進(jìn)化也是個(gè)“漸變”的過程。

但是, 以上研究均以分析高等真核生物中的研究數(shù)據(jù)為基礎(chǔ), 而沒有對(duì)處在真核細(xì)胞進(jìn)化關(guān)鍵地位的單細(xì)胞原生生物開展研究。以單細(xì)胞原生生物藍(lán)氏賈第蟲為例, 過去一直認(rèn)為它不具有核仁結(jié)構(gòu)(Li et al, 1997; Guo et al, 2005; Xin et al, 2005), 但近來的研究發(fā)現(xiàn)它也具有核仁結(jié)構(gòu), 只是它的核仁具有一些不同于高等真核生物核仁的特征：大小僅為0.2～0.5 μm, 約為一般核仁的 1/10; 核仁內(nèi)有 DFC和GC, 而沒有FC組分; 核仁可能存在于整個(gè)細(xì)胞周期中（Jimenez-Garcia et al, 2008), 這提示賈第蟲的核仁可能不同于高等真核生物的核仁。之前, 本實(shí)驗(yàn)室的研究結(jié)果表明賈第蟲的核糖體合成系統(tǒng)與高等真核生物相比較為簡單（Xin et al, 2005)。近期, 我們的工作比較分析了與核仁密切相關(guān)的 5S rRNA系統(tǒng), 結(jié)果發(fā)現(xiàn)賈第蟲具有簡單而又原始的5S rRNA系統(tǒng)（Feng et al, 2012)。這些研究均提示賈第蟲核仁與高等真核生物核仁的顯著不同。因此,僅基于高等真核生物中的數(shù)據(jù)而得出的結(jié)論可能不夠準(zhǔn)確。其次, 蛋白結(jié)構(gòu)域（domain)并不能完全代表蛋白, 因此核仁蛋白結(jié)構(gòu)域的起源并不能完全反映核仁蛋白的起源; 再者, 以單個(gè)物種的不完全的核仁蛋白數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)也不能夠全面地揭示核仁起源。

5 展 望

盡管目前對(duì)核仁的研究取得了較大進(jìn)展, 人們對(duì)核仁也有了更為深入的認(rèn)識(shí), 但是關(guān)于核仁仍存在許多未解之謎。

首先, 在結(jié)構(gòu)方面, 是什么組分保證了核仁結(jié)構(gòu)的完整性, 以致于它能夠被完整地純化分離且保持轉(zhuǎn)錄活性？研究數(shù)據(jù)表明一些核仁蛋白定位于核仁中并非FC、DFC和GC的亞核仁區(qū)域, 表明核仁結(jié)構(gòu)比人們之前認(rèn)識(shí)的更為復(fù)雜（Politz et al,2002, 2005), 那么核仁中還有哪些亞核仁區(qū)域？這些亞核仁區(qū)域是否與其新發(fā)現(xiàn)的功能有某種對(duì)應(yīng)關(guān)系呢？

其次, 在功能方面, 核仁作為核糖體生物合成場所這一主要功能已被充分證明, 同時(shí)不斷深入的研究又提示核仁具有一系列其他功能。但從前面可知, 這些新發(fā)現(xiàn)功能的主要證據(jù)往往是實(shí)驗(yàn)顯示相關(guān)的功能蛋白有核仁定位, 而并未得到很充分的證明。因此這方面的研究應(yīng)該成為今后較長一段時(shí)間內(nèi)核仁功能研究領(lǐng)域的重點(diǎn)。核仁為什么要參與諸多與核糖體生物合成無關(guān)的功能呢？已有的核仁蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)比較分析結(jié)果提示高等動(dòng)、植物核仁之間既具有一些共同的又各自存在一些特有的這類功能。單細(xì)胞原生生物賈第蟲核仁與高等真核生物核仁有著顯著差異, 前者成分要少得多、結(jié)構(gòu)也相對(duì)簡單, 那么這樣的原生生物核仁是否也具有多種功能呢？是否代表核仁進(jìn)化的早期階段, 從而通過對(duì)它們的研究可揭示這些新發(fā)現(xiàn)的功能是如何逐漸進(jìn)化形成的呢？

最后, 關(guān)于核仁起源與進(jìn)化, 盡管已有一些探索性的研究, 但目前仍是一個(gè)未解難題?，F(xiàn)在隨著基因和蛋白質(zhì)等組學(xué)數(shù)據(jù)的迅速積累, 對(duì)這一問題的探討出現(xiàn)了前所未有的機(jī)遇。目前雖然已經(jīng)有了三類高等真核生物的核仁蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫, 可是處于從原核生物向多細(xì)胞真核生物進(jìn)化的“過渡”階段的單細(xì)胞原生生物核仁蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)卻仍闕如。本實(shí)驗(yàn)室正致力于建立此類數(shù)據(jù)庫。通過不同進(jìn)化地位生物的核仁基因/蛋白質(zhì)組的比較分析, 勢必對(duì)揭示核仁起源進(jìn)化具有重要意義。