龐有旺 鄭季南 洪慶南 方 鈞

（解放軍泉州第180醫(yī)院骨科，泉州 362000）

近年來(lái)已經(jīng)證明的囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體有三種亞型［1～3］。其中Ⅰ、Ⅱ型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體廣泛、互補(bǔ)地分布于大腦皮質(zhì)、丘腦、延髓和脊髓等中樞神經(jīng)系統(tǒng)的谷氨酸能神經(jīng)終末內(nèi)［3～5］。目前已經(jīng)把Ⅰ、Ⅱ型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體作為谷氨酸能軸突終末的特異性標(biāo)識(shí)物。生理學(xué)研究表明谷氨酸是作用三叉神經(jīng)運(yùn)動(dòng)核神經(jīng)元的主要神經(jīng)遞質(zhì)，參與咀嚼、吮吸等活動(dòng)［6～7］，但有關(guān)谷氨酸陽(yáng)性終末在三叉神經(jīng)運(yùn)動(dòng)核的分布模式到目前未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究綜合應(yīng)用束路追蹤與免疫熒光組織化學(xué)相結(jié)合技術(shù)，對(duì)Ⅰ、Ⅱ型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體陽(yáng)性纖維在大鼠三叉神經(jīng)運(yùn)動(dòng)核內(nèi)的分布進(jìn)行了研究。

材料和方法

1.Ⅰ、Ⅱ型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體和神經(jīng)元核蛋白免疫熒光組織化學(xué)染色

雄性SD大鼠6只，體重250－280g。戊巴比妥鈉腹膜腔麻醉（40mg/kg）后，戊巴比妥鈉深麻下，插管至升主動(dòng)脈，先以100ml 0.025mol/L的PBS沖洗血液，再用500ml含4%多聚甲醛和75%飽和苦味酸的0.1mol/L的PB灌注固定，持續(xù)30min以上。灌畢立即取腦，并置入上述新鮮固定液中后固定4－6h，然后再移腦入含30%蔗糖的0.1mol/L的PB（pH 7.3）中，至其沉底。冰凍切片機(jī)行冠狀切片，片厚25μm，分為2套收集。

第1套切片用于Ⅰ、Ⅱ型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體和神經(jīng)元核蛋白免疫熒光三重染色。具體步驟如下：①小鼠抗神經(jīng)元核蛋白IgG（1∶1000；MAB377；Chemicon）和兔抗Ⅰ型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體IgG（0.8μg/ml，日本京都大學(xué)金子武嗣先生惠贈(zèng)）和豚鼠抗Ⅱ型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體IgG（0.8 μg/ml，日本京都大學(xué)金子武嗣先生惠贈(zèng)）的混合液室溫下孵育過(guò)夜；②生物素結(jié)合的驢抗兔IgG（10 μg/ml；Jackson，West Grove，PA）室溫下孵育3 h；③10%兔血清、Alexa647標(biāo)記的山羊抗小鼠（10 μg/ml；Molecular Probes）、Alexa594標(biāo)記的驢抗豚鼠IgG （10μg/ml；Molecular Probes）、Alexa488標(biāo)記的Avidin D（10μg/ml；Molecular Probes）的混合液中室溫下孵育2h?？贵w孵育液如前所述。

第2套切片用于對(duì)照實(shí)驗(yàn)。用正常血清替代一抗血清進(jìn)行免疫熒光組織化學(xué)染色，結(jié)果為陰性。

上述染色結(jié)果在激光共聚焦顯微鏡FV1000，Olympus，Japan）下觀察Ⅰ、Ⅱ型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體陽(yáng)性纖維在三叉神經(jīng)運(yùn)動(dòng)核內(nèi)分布（Alexa488的激發(fā)光波長(zhǎng)488nm，發(fā)射光波長(zhǎng)510－525nm；Alexa594的激發(fā)光波長(zhǎng)594nm；發(fā)射光波長(zhǎng)575－640 nm；Alexa647的激發(fā)光波長(zhǎng)647nm，發(fā)射光波長(zhǎng)700－720nm。

2.四甲基羅達(dá)明束路追蹤結(jié)合Ⅰ型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體和神經(jīng)元核蛋白免疫熒光組織化學(xué)染色

雄性SD大鼠6只，體重250－280g。戊巴比妥鈉腹膜腔麻醉（40mg/kg）后，手術(shù)暴露一側(cè)下頜舌骨肌神經(jīng)，微量注射器抽取2－3μl含10% 的四甲基羅達(dá)明水溶液，注入神經(jīng)內(nèi)。動(dòng)物存活4－5天后，戊巴比妥鈉腹膜腔麻醉（40mg/kg）后，戊巴比妥鈉深麻下，插管至升主動(dòng)脈，先以100ml 0.025mol/L的PBS沖洗血液，再用500ml含4%多聚甲醛和75%飽和苦味酸的0.1mol/L的PB灌注固定，持續(xù)30min以上。灌畢立即取腦，并置入上述新鮮固定液中后固定4－6h，然后再移腦入含30%蔗糖的0.1mol/L的PB（pH 7.3）中，至其沉底。冰凍切片機(jī)行冠狀切片，片厚25μm，分為2套收集。

第1套切片用于Ⅰ型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體和神經(jīng)元核蛋白免疫熒光雙重染色。具體步驟如下：①小鼠抗神經(jīng)元核蛋白IgG（1∶1000；MAB377；Chemicon）和兔抗Ⅰ型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體IgG（0.8μg/ml，日本京都大學(xué)金子武嗣先生惠贈(zèng)）的混合液室溫下孵育過(guò)夜；②生物素結(jié)合的驢抗兔IgG（10 μg/ml；Jackson，West Grove，PA）室溫下孵育3 h；③10%兔血清、Alexa647標(biāo)記的山羊抗小鼠（10 μg/ml；Molecular Probes）、Alexa488標(biāo)記的 Avidin D（10μg/ml；Molecular Probes，Eugene，OR）的混合液中室溫下孵育2h?？贵w孵育液如前所述。

第2套切片用于對(duì)照實(shí)驗(yàn)。用正常血清替代一抗血清進(jìn)行免疫熒光組織化學(xué)染色，結(jié)果為陰性。

上述染色結(jié)果在激光共聚焦顯微鏡FV1000，Olympus，Japan）下觀察Ⅰ、Ⅱ型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體陽(yáng)性纖維在三叉神經(jīng)運(yùn)動(dòng)核內(nèi)分布（Alexa488的激發(fā)光波長(zhǎng)488nm，發(fā)射光波長(zhǎng)510－525nm；四甲基羅達(dá)明的激發(fā)光波長(zhǎng)568nm；發(fā)射光波長(zhǎng)570－610nm；Alexa647的激發(fā)光波長(zhǎng)647nm，發(fā)射光波長(zhǎng)700－720nm。）

結(jié) 果

神經(jīng)元核蛋白標(biāo)記的三叉神經(jīng)運(yùn)動(dòng)核神經(jīng)元胞體較大，與周圍標(biāo)記神經(jīng)元對(duì)比鮮明，因而整個(gè)三叉神經(jīng)運(yùn)動(dòng)核邊界清楚（圖A）；Ⅰ型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體標(biāo)記的神經(jīng)元終末在三叉神經(jīng)運(yùn)動(dòng)核背外側(cè)部呈中等密度分布，在三叉神經(jīng)運(yùn)動(dòng)核的腹內(nèi)側(cè)部沒(méi)有分布（圖B），而Ⅱ型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體標(biāo)記的神經(jīng)元終末在三叉神經(jīng)運(yùn)動(dòng)核背外側(cè)部和腹內(nèi)側(cè)部均呈高密度分布（圖C）；在三叉神經(jīng)運(yùn)動(dòng)核內(nèi)，未見(jiàn)Ⅰ、Ⅱ型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體雙重標(biāo)記的神經(jīng)元終末，Ⅰ型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體標(biāo)記的神經(jīng)元終末個(gè)體明顯大于Ⅱ型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體標(biāo)記的神經(jīng)元終末（圖D）。

四甲基羅達(dá)明注射入下頜舌骨肌神經(jīng)逆行標(biāo)記的開(kāi)口神經(jīng)元聚集于三叉神經(jīng)運(yùn)動(dòng)核的腹內(nèi)側(cè)部，與位于三叉神經(jīng)運(yùn)動(dòng)核的背外側(cè)部的閉口神經(jīng)元胞體聚集區(qū)界限清楚。此時(shí)，我們可以清楚地觀察到在三叉神經(jīng)運(yùn)動(dòng)核內(nèi)沒(méi)有Ⅰ型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體陽(yáng)性終末分布的區(qū)域正好是開(kāi)口神經(jīng)元胞體聚集區(qū)域（圖F）。

討 論

谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的主要興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，作為負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)用谷氨酸到囊泡內(nèi)的囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體近年引起神經(jīng)科學(xué)研究者的關(guān)注［1～5］。已經(jīng)有較多形態(tài)學(xué)、生理學(xué)證據(jù)表明谷氨酸參與調(diào)控咀嚼活動(dòng)［10～12］，囊泡膜轉(zhuǎn)運(yùn)體抗體陽(yáng)性終末在三叉神經(jīng)運(yùn)動(dòng)核的分布模式具有重要研究意義。本研究則通過(guò)免疫組織化學(xué)結(jié)合逆行標(biāo)記觀察了Ⅰ、Ⅱ型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體在三叉神經(jīng)運(yùn)動(dòng)核不同區(qū)域的確切分布，我們觀察到Ⅰ型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體在三叉神經(jīng)運(yùn)動(dòng)核的閉口神經(jīng)元聚集區(qū)域內(nèi)中等密度分布，在開(kāi)口神經(jīng)元聚集區(qū)域內(nèi)沒(méi)有分布，而Ⅱ型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體在整個(gè)三叉神經(jīng)運(yùn)動(dòng)核內(nèi)均高密度分布。

已往的生理學(xué)研究表明從三叉神經(jīng)中腦核到三叉神經(jīng)運(yùn)動(dòng)核之間存在直接的單突觸興奮性通路，也存在間接的多突觸興奮性通路，從大腦皮層到三叉神經(jīng)運(yùn)動(dòng)核之間只存在間接的多突觸興奮性通路［14～15］。以往的形態(tài)學(xué)研究表明三叉神經(jīng)運(yùn)動(dòng)核內(nèi)的Ⅰ型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體陽(yáng)性終末為三叉神經(jīng)中腦核神經(jīng)元的中樞突終末［13］。本研究我們觀察到Ⅰ、Ⅱ型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體在三叉神經(jīng)運(yùn)動(dòng)核不同區(qū)域差異分布，其中一個(gè)顯著特征就是在三叉神經(jīng)運(yùn)動(dòng)核的腹內(nèi)側(cè)區(qū)未見(jiàn)Ⅰ型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體陽(yáng)性終末分布，我們進(jìn)一步逆行標(biāo)記了開(kāi)口神經(jīng)元，明確三叉神經(jīng)運(yùn)動(dòng)核內(nèi)沒(méi)有Ⅰ型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體陽(yáng)性終末分布的區(qū)域?yàn)殚_(kāi)口神經(jīng)元區(qū)。因而，本研究結(jié)果表明Ⅰ型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體在三叉神經(jīng)中腦核到閉口神經(jīng)元間的單突觸反射通路中發(fā)揮作用，而Ⅱ型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體則在大腦皮層或三叉神經(jīng)中腦核等核團(tuán)到三叉神經(jīng)運(yùn)動(dòng)核開(kāi)口和閉口神經(jīng)元的多突觸通路中發(fā)揮作用。

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