謝 靜，賈庶捷，林 於

（重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室，重慶400016）

奇異變形桿菌蛋白質(zhì)雙向電泳條件的優(yōu)化及評(píng)價(jià)

謝 靜，賈庶捷，林 於

（重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室，重慶400016）

目的：優(yōu)化針對(duì)奇異變形桿菌蛋白質(zhì)組學(xué)研究的雙向電泳 （2－DE）條件及其相關(guān)技術(shù)體系，闡明樣品處理過(guò)程中超聲功率、振搖時(shí)間和上樣量對(duì)2－DE圖譜的影響。方法：選取1株奇異變形桿菌，分別采用超聲功率為130W和80W超聲法裂解菌體提取總蛋白，將2種方法提取的蛋白在同一條件下進(jìn)行等電聚焦和聚丙烯酰胺凝膠電泳 （SDS－PAGE）；超聲功率為80W提取的奇異變形桿菌總蛋白，分別取上樣量1和2mg，在同一條件下17cm膠條上進(jìn)行雙向電泳。結(jié)果：超聲功率為130W處理的樣本得到的2－DE圖譜中蛋白斑點(diǎn)較少，而超聲功率為80W處理的樣本蛋白點(diǎn)多、清晰且重復(fù)性好。上樣量為2mg得到的圖譜中橫縱條紋明顯，蛋白斑點(diǎn)分離度較差，而上樣量為1mg時(shí)橫縱條紋較少，蛋白斑點(diǎn)分離度較好。結(jié)論：采用低功率超聲且較少上樣量處理樣品能得到較好的2－DE圖譜。

奇異變形桿菌；蛋白質(zhì)組學(xué)；雙向電泳

奇異變形桿菌 （Proteusmirabilis，PM）作為腸桿菌科的一員，是復(fù)雜性尿路感染的主要病因［1］。奇異變形桿菌和普通變形桿菌可引起人的原發(fā)性和繼發(fā)性感染。近年來(lái)關(guān)于奇異變形桿菌基因組研究發(fā)展迅猛，國(guó)內(nèi)外相繼發(fā)表了許多關(guān)于其基因組學(xué)研究成果。蛋白質(zhì)不僅是基因的表達(dá)產(chǎn)物而且作為基因功能的最終體現(xiàn)者，蛋白質(zhì)組學(xué)已成為功能基因組學(xué)的主要研究?jī)?nèi)容之一［2］。雙向凝膠電泳 （2－DE）技術(shù)最早是在分離大腸桿菌總蛋白時(shí)發(fā)展起來(lái)的，目前已廣泛地用于分離哺乳動(dòng)物細(xì)胞、組織和生理體液等復(fù)雜蛋白質(zhì)組，成為蛋白質(zhì)組研究的核心技術(shù)之一［3－4］，但關(guān)于奇異變形桿菌蛋白質(zhì)2－DE條件的優(yōu)化國(guó)內(nèi)尚外未見(jiàn)報(bào)道。本研究選用1株本研究室自存的奇異變形桿菌，優(yōu)化2－DE實(shí)驗(yàn)條件，旨在為后續(xù)研究奇異變形桿菌蛋白質(zhì)組學(xué)奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、主要試劑及儀器 第三軍醫(yī)大學(xué)生物波研究室自存的奇異變形桿菌菌株1株。LB固體培養(yǎng)基 （100mL）：胰蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，氯化鈉1g，加蒸餾水至100mL，調(diào)pH至7.2～7.4，加入瓊脂2g，臨用前加入2，3，5－氯化三苯基四氮唑 （TTC）水溶液 （10%TTC、0.4mol·L－1琥珀酸鈉、0.36%氯化鈉）1mL，20%葡萄糖0.5mL，TTC水溶液和20%葡萄糖以0.75×105Pa滅菌15min。固相pH梯度干膠條（pH 3～10，7cm，17cm）、3－ ［（3－膽酰胺基丙基）二甲基銨基］－1－丙磺酸鹽 （CHAPS）、兩性電解質(zhì) （Bio－Lyte）、三羥基磷 （TBP）、尿素、硫脲、礦物油和碘乙酰胺均購(gòu)自BIO－RAD公司。十二烷基磺酸鈉 （SDS）、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、N，N，N′，N′－四甲基乙二胺 （TEMED）、三羥甲基氨基甲烷 （Tris）均為進(jìn)口試劑，其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。所有實(shí)驗(yàn)過(guò)程用水均為超純水。

1.2 奇異變形桿菌總蛋白的提取 奇異變形桿菌點(diǎn)種于20g·L－1瓊脂LB平板，37℃培養(yǎng)18h，方法1：取菌體懸浮于40mmol·L－1、pH 7.5的Tris－Hcl溶 液［6］，4 ℃、10 000r·min－1離 心10min，收集菌體沉淀，加入2mL未加二硫蘇糖醇 （DTT）的裂解液 （7mol·L－1尿素、2mol·L－1硫脲、4%3－［（3－膽酰胺基丙基）二甲基銨基］－1－丙磺酸鹽 （CHAPS）、0.2% 兩性電解質(zhì) （Bio－Lyte）、0.001%溴酚藍(lán)）以及10mmol·L－1苯甲基磺酰氟 （PMSF），混懸后置冰水浴中超聲破菌，功率130W，每次9s，間歇8s，共15min。每管中再加入200mg·L－1DNaseⅠ、50mg·L－1RNase A和65mmol·L－1DTT，4℃放置30min，然后15 000r·min－1離心30min［7］，將上清按每管100μL分裝，－70℃凍存。方法2：裂解過(guò)程為功率80W，每次9s，間歇8s，共30min。4℃放置30min后室溫振搖過(guò)夜。其余處理過(guò)程同方法1。采用Brad－ford法測(cè)定蛋白含量。

1.3 樣品水化 分別采用7和17cm的膠條進(jìn)行等電聚焦，7cm膠條上樣量為500μg，上樣體積150μL；17cm膠條上樣量為1和2mg，上樣體積500μL。不足上樣體積用水化上樣緩沖液補(bǔ)充（7mol·L－1尿素、2mol·L－1硫脲、4%CHAPS、0.2%Bio－Lyte、65mmol·L－1DTT和0.001%溴酚藍(lán)）。另外加入體積分?jǐn)?shù)為1%的TBP，混勻后，線性上樣于溶脹盤中，膠條膠面朝下置于樣品上，溶脹1h后，加入礦物油防止樣品揮發(fā)。水化12～16h。

1.4 固相pH梯度等電聚焦條件 將水化后的樣品從溶脹盤轉(zhuǎn)移到聚焦盤，重新覆蓋礦物油，設(shè)置等電聚焦程序。7cm膠條：①250V，1h，線性；②500V，1h，快速；③4 000V，3h，線性；④ 4 000V，20 000 伏小時(shí) （VH），快速；⑤500V，任意時(shí)間，快速。17cm膠條：①250V，1.5h，線 性； ② 1 000V，1.5h， 線 性；③6 000V，2.5h，線性；④ 10 000V，2.5h，線 性；⑤10 000V，60 000 伏 小 時(shí) （VH）；⑥500V，任意時(shí)間，快速。

1.5 SDS－聚丙烯凝膠電泳 聚焦結(jié)束后，膠條分別在平衡緩沖液Ⅰ、Ⅱ中平衡15min，然后轉(zhuǎn)移至10%SDS－PAGE分離膠上，低熔點(diǎn)瓊脂糖封膠液覆蓋膠條，待其凝固后，7cm膠條50V、30min，120V至溴酚藍(lán)前沿到玻璃板底部停止。17cm膠條60V、1h，180V至溴酚藍(lán)前沿到玻璃板底部停止。電泳完成后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)R－250染色過(guò)夜，脫色至背景清晰，比較蛋白斑點(diǎn)數(shù)量、蛋白點(diǎn)分離度、膠上橫縱條紋以及背景是否清晰。

2 結(jié) 果

采用方法2提取細(xì)菌蛋白時(shí)，2條7cm膠條上樣量為500μg，得到蛋白點(diǎn)清晰、無(wú)橫縱條紋，且重復(fù)性好的2－DE圖譜，見(jiàn)圖1（插頁(yè)四）。采用方法1提取奇異變形桿菌蛋白質(zhì)時(shí)，上樣量為1mg，經(jīng)過(guò)等電聚焦、平衡、SDS－PAGE和考馬斯亮藍(lán)R－250染色，得到的2－DE圖譜中蛋白斑點(diǎn)較少 （圖2A，見(jiàn)插頁(yè)四）?？紤]對(duì)于17cm膠條上樣量1mg已足夠，檢測(cè)到的蛋白斑點(diǎn)少不是由于上樣量不夠，而可能是由于蛋白質(zhì)溶解不夠或處理過(guò)程被降解導(dǎo)致。方法1中超聲處理功率較高，但處理過(guò)程產(chǎn)熱較多，會(huì)使蛋白質(zhì)發(fā)生降解。另外，方法2提取蛋白質(zhì)將樣品振搖過(guò)夜，有利于蛋白質(zhì)的溶解。按照方法2提取奇異變形桿菌蛋白，2條17cm的膠條上樣量為1和2mg，經(jīng)過(guò)相同條件的等電聚焦、平衡、SDS－PAGE和考馬斯亮藍(lán)R－250染色，上樣量為1mg的2－DE圖譜蛋白斑點(diǎn)分離度較好，無(wú)明顯的橫縱條紋 （圖2B，見(jiàn)插頁(yè)四）；上樣量為2mg的2－DE圖譜橫縱條紋明顯，蛋白斑點(diǎn)分離度較差 （圖2C，見(jiàn)插頁(yè)四）。

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)以奇異變形桿菌蛋白為研究對(duì)象進(jìn)行2－DE分析，并對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中細(xì)菌裂解條件、電泳上樣量等進(jìn)行了改進(jìn)和優(yōu)化。2－DE最完美的樣品制備是保證所有蛋白質(zhì)在制備過(guò)程中不被修飾地大量溶解出來(lái)，而且還要在某種程度上與第一向分離兼容，同時(shí)排除可能會(huì)干擾第一向分離的生物化合物［8］。樣品制備主要步驟為細(xì)菌裂解，該過(guò)程中出現(xiàn)的問(wèn)題將直接對(duì)2－DE的結(jié)果產(chǎn)生影響。為了防止蛋白質(zhì)被破碎的細(xì)菌釋放的蛋白酶水解，本研究選擇在破碎液體中加入蛋白酶抑制劑PMSF。溫度變化對(duì)蛋白影響較大，選擇在冰浴條件下超聲破碎提取奇異變形桿菌蛋白質(zhì)，破碎后又加入RNaseA及DNaseⅠ酶于低溫下消化DNA及RNA。由于PMSF在含有巰基的試劑中效果較差 （如DTT），裂解液中的DTT選擇在超聲裂解完細(xì)菌后再加入。本實(shí)驗(yàn)所用的細(xì)胞裂解液配方是在多次測(cè)試后得到的。本研究結(jié)果顯示：方法2結(jié)果優(yōu)于方法1，但是否存在時(shí)間、功率和結(jié)果間的正相關(guān)性仍需進(jìn)一步研究。為了保證2－DE圖譜中每個(gè)點(diǎn)都有足夠量用于檢測(cè)，上樣量往往依據(jù)樣品中蛋白種類多少和膠條種類進(jìn)行選擇，上樣量過(guò)大會(huì)導(dǎo)致圖譜出現(xiàn)橫條紋，過(guò)小則會(huì)導(dǎo)致低豐度蛋白不能被檢測(cè)。有報(bào)道［9］指出：外槽液的泄漏也可導(dǎo)致縱條紋的產(chǎn)生。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：對(duì)于17cm膠條，1mg上樣量得到的蛋白點(diǎn)中可辨別的點(diǎn)較清晰且多，達(dá)到了預(yù)期效果?？捡R斯亮藍(lán)染色具有易于操作、重復(fù)性好、價(jià)格低廉和無(wú)毒性等優(yōu)點(diǎn)，是目前實(shí)驗(yàn)室中較為常用的兩種顯色方法中靈敏度較低的一種。另一種染色方法銀染法雖然靈敏度比考馬斯亮藍(lán)染色高100倍，但銀離子對(duì)質(zhì)譜儀干擾嚴(yán)重，且脫銀的方法復(fù)雜，不易于掌握，所以銀染一般用于分析。鑒于銀染過(guò)程繁瑣且重復(fù)性差，加上銀染的圖像背景清晰度較低，本實(shí)驗(yàn)選擇采用考馬斯亮藍(lán)染色。

隨著2－DE技術(shù)、生物質(zhì)譜技術(shù)和生物信息學(xué)等蛋白質(zhì)組學(xué)研究工具的迅速發(fā)展，微生物與蛋白質(zhì)組學(xué)的結(jié)合顯得順理成章［10］。微生物蛋白質(zhì)組學(xué)主要研究與微生物活動(dòng)相關(guān)的蛋白質(zhì)，在不同的環(huán)境條件下，微生物相關(guān)功能基因組和蛋白質(zhì)得到表達(dá)，用2－DE將其蛋白質(zhì)分離，比較2－DE圖譜差異，鑒定差異蛋白質(zhì)，確定與活動(dòng)功能相關(guān)的基因，從而闡明基因組功能。盡管1－D圖譜和2－D圖譜在研究中都能達(dá)到目的，但2－D圖譜的顯著優(yōu)勢(shì)在于能提供高分辨率以及對(duì)標(biāo)記蛋白的后續(xù)檢測(cè)［11］。2－DE作為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的主要技術(shù)，仍然存在著技術(shù)上的局限性，尚不能較好處理低豐度及過(guò)酸、過(guò)堿蛋白。隨著技術(shù)的革新，該方法將會(huì)有更為廣闊的應(yīng)用前景。有研究［12］指出：未來(lái)2－DE的目的是確定蛋白質(zhì)的數(shù)量和質(zhì)量。

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Optimization and evaluation of two－dimensional electrophoresis conditions ofProteusmirabilis

XIE Jing，JIA Shu－jie，LIN Yu
（Department of Pharmacognosy，College of Pharmacy，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China）

ObjectiveTo optimize the conditions of two－dimensional electrophoresis （2－DE）and its related techniques in research on proteomics ofProteusmirabilis，and to elucidate the effects of the supersonic power，the agitate time and the loading amount of proteins on 2－DE maps.MethodsOne strain ofProteusmirabiliswas chosen，and its proteins were extracted by sonicating on a sonicator fitted with a microprobe.and the supersonic powers were 130Wand 80W.The same condition of immobilized pH gradient isoelectric focusing and SDS－PAGE was used to separate the proteins obtained from the two ways.1and 2mg of samples of the total proteins obtained fromProteusmirabilisby 80Wsupersonic power were collected for 2－DE on 17cm IPG strips under the same condition.ResultsThe 2－DE map of the proteins obtained by 130Wsupersonic power was clear，repeatable and had more protein spots than that obtained by 80Wsupersonic power.The 2－DE map with sample amount of 1mg exhibited less vertical and horizontal stripes than that of 2mg， which appeared good repeatability.ConclusionAdopting lower supersonic power and a few of samples can get better 2－DE map.

Proteusmirabilis；proteomics；two－dimensional electrophoresis

R378.2

A

1671－587Ⅹ（2012）06－1219－04

2012－06－10

國(guó)家自然科學(xué)基金資助課題 （31070445）

謝 靜 （1988－），女，重慶市人，在讀藥學(xué)碩士，主要從事微生物蛋白質(zhì)組學(xué)方面的研究。

林 於 （Tel：023－65712062，E－mail：linyu5819＠163.com）