朱英奇,李 露,王世傳,陳宗艷,李傳峰,劉光清
(1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,合肥 230036;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所,上海 200241;3.江西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,南昌 330045;4.安徽省全椒縣畜牧獸醫(yī)局,全椒 239500)
雞傳染性支氣管炎( Avian infectious bronchitis,IB) 是由傳染性支氣管炎病毒(Infectious bronchitis virus, IBV)引起的雞一種急性、高度接觸性傳染病。雞群感染IBV后,可以對(duì)呼吸道、泌尿生殖系統(tǒng)或消化系統(tǒng)造成嚴(yán)重?fù)p傷,對(duì)養(yǎng)雞業(yè)的威脅比較大[1]。雛雞主要表現(xiàn)為高發(fā)病率和死亡率,成年蛋雞和種雞的病死率雖然比較低,但是由于可發(fā)生產(chǎn)蛋顯著下降,產(chǎn)軟殼蛋、畸形蛋以及孵化率下降等,給養(yǎng)禽業(yè)造成的損失更大[2,3]。 因此,雞傳染性支氣管炎一直是養(yǎng)雞企業(yè)重點(diǎn)防范的重要疫病之一[4]。但是,由于IBV血清型眾多,不同血清型之間交叉保護(hù)效果差,基因組的不斷變異和重組情況也不斷出現(xiàn),使得雞傳染性支氣管炎的防控形勢(shì)十分嚴(yán)峻[5,6]。因此,當(dāng)疫情發(fā)生時(shí),及時(shí)進(jìn)行病原分離和鑒定,對(duì)于正確防治雞傳染性支氣管炎具有重要的指導(dǎo)意義。2011年,上海市附近某規(guī)?;B(yǎng)雞場(chǎng)持續(xù)發(fā)生以呼吸障礙、產(chǎn)蛋下降和產(chǎn)畸形蛋為主要特征的疫病。我們通過(guò)臨床診斷、病毒分離和鑒定,確定該疫情是由傳染性支氣管炎病毒感染引起,現(xiàn)報(bào)道如下。
1.1 雞胚及雛雞 9~11日齡SPF雞胚和1日齡雛雞購(gòu)自上海家禽育種有限公司;新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)Lasota 毒株為上海獸醫(yī)研究所禽病實(shí)驗(yàn)室保存。
1.2 病毒的分離 無(wú)菌取具病雞肺和腎臟,將病料1:5加滅菌生理鹽水研磨成乳狀,反復(fù)凍融3 次,10 800×g,4℃離心30 min ,取上清,用0.22μm微孔濾膜除菌。經(jīng)尿囊腔接種10日齡SPF雞胚,每胚接種0.2 mL,37℃孵育,棄去24 h內(nèi)死亡雞胚。96 h后,無(wú)菌收集尿囊液再接種10日齡SPF雞胚,如此連傳3代。
1.3 雞胚半數(shù)感染量(EID50)的測(cè)定 取30枚10日齡SPF雞胚,分6組,每組5枚雞胚。將病毒液稀釋成10-2~10-7倍,每個(gè)稀釋度接種5枚SPF雞胚,0.2 mL /枚。每天照蛋2次,觀察雞胚狀況并記錄死亡情況,死亡雞胚放4℃保藏。孵化至15日齡,無(wú)菌收集尿囊液。按Read-Muench方法計(jì)算EID50。
1.4 干擾NDV增殖試驗(yàn) 將10日齡SPF雞胚分為3組,每組10枚。第1組雞胚經(jīng)尿囊腔接種分離株第5代雞胚尿囊液毒(0.2 mL/胚),37℃孵化10 h 后,接種NDV Lasota株(0.2 mL/胚);第2組與第1組同時(shí)接種NDV Lasota株(0.2 mL/胚);第3組為生理鹽水對(duì)照組;繼續(xù)孵化48 h,無(wú)菌收集尿囊液,按常規(guī)方法測(cè)尿囊液的血凝效價(jià)。
1.5 動(dòng)物回歸試驗(yàn) 用第5代SPF雞胚尿囊液毒以滴鼻途徑接種15日齡SPF雛雞10只,0.2 mL/只(EID50=10-5.3/0.2 mL),同時(shí)以10只同日齡雛雞注射滅菌生理鹽水,作為對(duì)照,連續(xù)觀察10 d,剖殺所有未死亡試驗(yàn)雞。
1.6 RT-PCR檢測(cè) 根據(jù)GenBank中發(fā)表的IBV核苷酸序列(NC_001451),設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物,上游引物:5'-TGGATAGTGTGGGTTGCTG-3',下游引物:5'-CCATCCTTA ATACCTTCCTC-3',預(yù)期PCR產(chǎn)物為445 bp。
病毒RNA的抽提及cDNA第一鏈的合成按照文獻(xiàn)[3]進(jìn)行。PCR擴(kuò)增條件:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性1 min,50℃退火1 min,72℃延伸1 min,共30個(gè)循環(huán);最后于72℃延伸10 min。取5 μL PCR進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,最后PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析。
2.1 病毒的分離 對(duì)兩份來(lái)自不同雞舍的的病料進(jìn)行雞胚分離,結(jié)果表明病毒盲傳3代后出現(xiàn)死亡,主要集中在48~96 h,可見頭頸部、胸部、腿部等處出現(xiàn)點(diǎn)狀出血(圖1b-c),未死雞胚則出現(xiàn)典型變化,表現(xiàn)為胚體發(fā)育受到抑制,出現(xiàn)侏儒胚,胚體卷曲(圖1d),胚腹腔有明顯的尿酸鹽沉積等特征性病理變化。
圖1 SPF雞胚接種病毒后的特征性病變Fig.1 The gross lesion of SPF chicken embryos inoculated with the isolated virus
2.2 雞胚半數(shù)感染量(EID50)的測(cè)定 將病毒液稀釋成102~107倍,每個(gè)稀釋度接種5枚SPF雞胚,0.2 mL/枚,37℃孵化5 d。按照Read-Muench方法計(jì)算該病毒的EID50的值為5×105.3。
2.3 NDV增殖干擾試驗(yàn) HA結(jié)果顯示,第1組雞胚尿囊液的平均血凝價(jià)為29,第2組雞胚尿囊液平均血凝效價(jià)為211,說(shuō)明分離毒株可以明顯影響NDV在雞胚中的復(fù)制,能使其血凝效價(jià)降低2個(gè)滴度,與以往報(bào)道的情況一致。
2.4 動(dòng)物回歸試驗(yàn) 用分離病毒的尿囊液接種15日齡SPF雞以后,d4感染雞開始出現(xiàn)咳嗽、精神沉郁、噴嚏,羽毛凌亂,兩翅下垂,拉白色水樣稀糞等癥狀。d5出現(xiàn)死亡,病死率20%。對(duì)病死雞進(jìn)行解剖,可見氣管內(nèi)有大量粘液,喉頭出血,腎臟腫大,呈典型的花斑腎,輸尿管和腎小管內(nèi)充滿尿酸鹽結(jié)晶等腎型傳染性支氣管炎的特征病理變化。而對(duì)照組則沒有明顯病理變化。
2.5 RT-PCR檢測(cè)及序列測(cè)定結(jié)果 分別取攻毒組死亡雞和對(duì)照組雞肺臟和腎臟勻漿,反復(fù)凍融3次后,組織液進(jìn)行RT-PCR檢測(cè),結(jié)果在攻毒組雞肺臟和腎臟中擴(kuò)增出預(yù)期大小的PCR產(chǎn)物(圖2)。
圖2 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果Fig.2 The detection results of RT-PCR
利用BLAST程序,將測(cè)得的序列進(jìn)行網(wǎng)上比對(duì),發(fā)現(xiàn)它與冠狀病毒科中的雞傳染性支氣管炎病毒具有較高的親緣關(guān)系。其核苷酸與CK/CH/LDL/05III、CK/CH/LHLJ/06II、CK/CH/LGD/96I、HZ等分離株的同源性最高,達(dá)99%;與CK/CH/SD09/001、GXNN6、CK/CH/LHLJ/99I、LX4等分離株的同源性稍低,為95%。
雞傳染性支氣管炎是高度接觸性傳染病,該病自1937年被正式報(bào)道以來(lái),世界各國(guó)已分離并鑒定出許多不同血清型的IBV,且每年都有新的血清型出現(xiàn)。由于雞傳染性支氣管炎的臨床癥狀復(fù)雜,病原血清型較多,且彼此之間的交叉保護(hù)率較低,給疫病防治帶來(lái)很大困難,致使IB疫情綿延不斷,一直得不到很好的控制。最近,上海市某養(yǎng)雞場(chǎng)不斷發(fā)生以產(chǎn)蛋下降和呼吸障礙為特征的疫情,給生產(chǎn)帶來(lái)較大損失。接到疫情報(bào)道后,我們實(shí)驗(yàn)室從臨床發(fā)病雞腎病料中分離到1株病毒,經(jīng)HA試驗(yàn)、電鏡觀察、理化特性測(cè)定、血清學(xué)鑒定和動(dòng)物回歸試驗(yàn)等多種試驗(yàn)方法檢測(cè),確診為腎型雞傳染性支氣管炎病毒。用該分離株的第5代SPF雞胚尿囊液接種非免疫雞,可復(fù)制出與自然發(fā)病雞相同的臨床癥狀,尤其以腎臟腫大、呈花斑樣和輸尿管中有多量白色尿酸鹽沉積為明顯特征,表明此毒株具有很強(qiáng)的嗜腎性,與以往報(bào)道的腎型傳染性支氣管炎病毒嗜腎毒株特征一致[7],證實(shí)本次分離的病原為傳染性支氣管炎病毒嗜腎毒株。
因IBV核蛋白(N)基因在各型毒株間相對(duì)保守,常作為PCR檢測(cè)的靶基因[8],本試驗(yàn)即以參考毒株的N基因序列設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物,并從疑似病料中擴(kuò)增出了預(yù)期大小的基因片段,經(jīng)序列測(cè)定,證實(shí)為傳染性支氣管炎的特異性核酸序列。將該分離株的N基因序列與GenBank中登錄的多株國(guó)內(nèi)外參考毒株進(jìn)行比對(duì),發(fā)現(xiàn)其與國(guó)內(nèi)流行毒株:CK/CH/LDL/05III、CK/CH/LHLJ/06II、CK/CH/LGD/96I、HZ等分離株的核苷酸同源性均比較高。鑒于N基因是比較保守的核蛋白基因,因此可以根據(jù)其序列對(duì)IBV進(jìn)行基因分型。探討IBV SH11株與參考毒株之間的遺傳演化關(guān)系、致病特性和抗原變異等方面的研究將是我們下一步的研究方向。
[1] B W 卡爾尼克.禽病學(xué)[M].10版.高福, 蘇敬良, 譯.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 1999: 653-665.
[2] Liu S W, Kong X G.A new genotype of nephropathogenic infectious bronchitis virus circulating in vaccinated and non-vaccinated flocks in China[J].Avian Pathol, 2004,33(3): 321-327.
[3] Liu S W, Zhang Q X, Chen J D,et al.Genetic diversity of Avian infectious bronchitis coronavirus strains isolated in China between 1995 and 2004[J].Arch Virol, 2006,151(6): 1133-1148.
[4] Liu S W, Chen J F, Chen J D,et al.Isolation of avian infectiou bronchitis coronavirus from domestic peafowl(Pavo cristatus) and teal(Anas)[J].J Gen Virol, 2005,86(Pt3): 719-725.
[5] Gelb J Jr, Wolff J B, Moran C A.Variant serotypes of infectious bronchitis virus isolated from commercial layer and broiler chickens [J].Avian Dis, 1991, 35(1): 82-87.
[6] Gelb J Jr, Keeler C L Jr, Nix W A,et al.Antigenic and S-1 genomic characterization of the Delaware variant serotype of infectious bronchitis virus [J].Avian Dis, 1997, 41(3):661-669.
[7] 鄺榮祿.雞傳染性支氣管炎腎病變型在廣東的發(fā)現(xiàn)[J].養(yǎng)禽與禽病防治, 1982,1(3): 44.
[8] 何長(zhǎng)生, 魏建忠, 王桂軍, 等.雞腎型傳染性支氣管炎病毒的分離鑒定[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2004, 26(1): 39-41.