祁 茹 溫建新 肖 宇 林英庭

（青島農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，青島 266109）

目前，在微生物活菌計數(shù)和檢測中，常用方法有傾注平板法、平板涂布法、平板劃線法、濾膜法、MPN法和亨氏管法等。張銀旺（2005）[1]用平板涂布法培養(yǎng)雙歧桿菌計數(shù)，潘靈輝（2005）[2]和趙曉靜（2005）[3]等用平板涂布法培養(yǎng)乳酸桿菌和雙歧桿菌并計數(shù)。本文研究涂布、傾注和亨氏管法3種不同培養(yǎng)方式對厭氧微生物乳酸桿菌和雙歧桿菌檢出率的影響。

1 材料與方法

1.1 樣品

嶗山奶山羊新鮮糞便

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 乳酸桿菌計數(shù)用培養(yǎng)基 MRS瓊脂培養(yǎng)基，購于青島海博生物技術有限公司，配方（g/L）：水解酪蛋白：10.0；大豆胨：5.0；酵母粉：2.0；葡萄糖：5.0；L-半胱氨酸：0.5；磷酸氫二鉀：2.0；氯化鎂：0.5；硫酸鋅：0.25；氯化鈣：0.15；氯化鐵：0.000001；瓊脂：20.0；吐溫80：1.0。pH值6.5 ± 0.1。

1.2.2 雙歧桿菌計數(shù)培養(yǎng)基 TPY瓊脂培養(yǎng)基，購于青島海博生物技術有限公司，配方（g/L）蛋白胨：10.0；酵母浸粉：8.0；葡萄糖：4.0；磷酸氫二鉀：20.0；檸檬酸氫二銨：2.0；乙酸鈉：2.0；硫酸鎂：5.0；硫酸錳：0.04；瓊脂：14.0；吐溫80：1.0。pH值6.5 ± 0.2。

1.3 計數(shù)及鑒定

按照GB4789.2-2010和GB 4789.35-2010進行。

1.4 試驗方法

稀釋液的制備：稱取1 g新鮮糞便放入9 ml無菌生理鹽水中，充分混勻，制成1∶10的樣品勻液。用移液器移取1∶10的樣品勻液1 ml，沿管壁緩慢注于盛有9 ml稀釋液的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管使其混合均勻，制成1∶100的樣品勻液。依次類推，制備10倍系列稀釋樣品勻液[4]。

1.4.1 平板涂布法 預實驗選取3個適宜的稀釋度（每個稀釋度2個重復），同時作滅菌生理鹽水空白對照。每個稀釋度吸取0.1ml樣品勻液滴于預先傾注好的培養(yǎng)基表面中央位置，用無菌的L棒均勻涂布，室溫靜置5～10 min后將平板倒置于厭氧培養(yǎng)罐中37℃恒溫培養(yǎng)48h±2h后計數(shù)。

1.4.2 傾注平板法 預實驗選取3個適宜的稀釋度（每個稀釋度2個重復），同時作滅菌生理鹽水空白對照。每個稀釋度吸取0.1 ml樣品勻液對號放入編好號的無菌平皿中，轉(zhuǎn)動平皿使其均勻分散，盡快向平皿中導入融化后冷卻至45℃左右的培養(yǎng)基約15 ml，再次轉(zhuǎn)動平皿使培養(yǎng)基與菌液混合均勻。待培養(yǎng)基凝固后，將平板倒置于厭氧培養(yǎng)罐中37℃恒溫培養(yǎng)48 h±2 h后計數(shù)。

1.4.3 亨氏管培養(yǎng)法 預實驗選取3個適宜的稀釋度（每個稀釋度2個重復），同時作滅菌生理鹽水空白對照。每個稀釋度吸取0.1 ml樣品勻液，加入裝有5 ml無菌無氧培養(yǎng)基（融化后冷卻至45℃左右）的亨氏管中，將其平放于盛有冰塊的盤中迅速滾動，培養(yǎng)基環(huán)亨氏管內(nèi)壁凝固，置于厭氧培養(yǎng)罐中37℃恒溫培養(yǎng)48 h±2 h后計數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析應用SPSS17.0、One way ANOVA進行方差分析和LSD 多重比較，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標準。

2 結果與分析

2.1 不同培養(yǎng)方式對微生物計數(shù)檢出的影響

表1 不同培養(yǎng)方式對乳酸桿菌和雙歧桿菌計數(shù)的影響（log10CFU/g鮮糞）

標準差是反應數(shù)據(jù)離散程度、精密度的一種量化形式。由表1可知，與平板涂布法和傾注平板法相比，亨氏管法用于培養(yǎng)乳酸桿菌和雙歧桿菌對微生物計數(shù)的結果精確度好，再現(xiàn)性高。

2.2 不同培養(yǎng)方式對乳酸桿菌計數(shù)檢出的影響

乳酸桿菌在MRS瓊脂培養(yǎng)基上菌落生長特征：菌落黃白色，表面光滑，凸起，邊緣整齊，不透明，質(zhì)地軟，濕潤，直徑0.6～2.7mm。

革蘭氏染色：陽性。

涂片鏡檢：乳桿菌屬菌體形態(tài)多樣，呈單、雙、短鏈或柵狀排列，無芽胞。

從表1可知，采用傾注平板法計數(shù)乳酸桿菌數(shù)（對數(shù)）為11.0405，P值為0.058，即樣本中變量關聯(lián)有5.8%的可能是由于偶然性造成的，此方法優(yōu)于平板涂布10.9798±0.099和亨氏管法的9.766±0.267。因此，乳酸桿菌適宜采用傾注平板法培養(yǎng)計數(shù)。

2.3 不同培養(yǎng)方式對雙歧桿菌計數(shù)檢出的影響

雙歧桿菌在TPY瓊脂培養(yǎng)基上菌落生長特征：菌落表面光滑，凸起，邊緣整齊呈奶油色、瓷白色，質(zhì)地柔軟、細膩，不透明，直徑2.1～3.5 mm。

革蘭氏染色：陽性。

涂片鏡檢：雙歧桿菌屬菌體形態(tài)具有多形性，有分支呈Y、V形或棒狀，標本有醋酸氣味。

綜合分析表1中平板涂布法、傾注平板法、亨氏管培養(yǎng)法檢測雙歧桿菌的均值、標準差、標準誤及P值，亨氏管法組均值大于平板涂布法組和傾注平板法組，且其標準差和標準誤都遠小于其他兩組，故筆者認為在本試驗條件下計數(shù)雙歧桿菌適宜用亨氏管法進行。

3 討論

本試驗涉及平板涂布法、傾注平板法、亨氏管培養(yǎng)法，3種方法的優(yōu)缺點如下：

（1）平板涂布法：適用于需氧微生物的菌落觀察，菌落一般在培養(yǎng)基表面著生，培養(yǎng)基是固態(tài)的，但有時菌液分布不均勻，而且涂布棒上會帶走部分菌液，是計數(shù)結果小于真實結果，容易使結果產(chǎn)生負偏差。

（2）傾注平板法：適用于厭氧和兼性厭氧菌，不適合需氧和對熱敏感的細菌培養(yǎng)，菌落在培養(yǎng)基表面和內(nèi)部都會生長，培養(yǎng)基是液態(tài)的，操作相對麻煩。

（3）亨氏管培養(yǎng)法：適用于專性厭氧菌，不適合需氧和對熱敏感的細菌培養(yǎng)，菌落在培養(yǎng)基表面和內(nèi)部都會生長，不易染菌，培養(yǎng)基是液態(tài)的，操作相對簡便。

乳酸桿菌（Lactobacillus）屬于硬壁菌門（Firmicutes）桿菌綱（Bacilli）乳酸桿菌目（Lactobacillales）乳酸桿菌科（Lactobacillaceae），能發(fā)酵葡萄糖（或利用碳水化合物）產(chǎn)生大量乳酸，屬兼性厭氧菌。采用涂布法培養(yǎng)乳酸桿菌會使或多或少的細菌受到空氣中氧氣的損傷而影響菌落的檢測和計數(shù)，用亨氏管培養(yǎng)乳酸桿菌又會阻礙乳酸桿菌的有氧呼吸。本試驗條件下用傾注平板法計數(shù)乳酸桿菌效果最優(yōu)。

雙歧桿菌是一類專性厭氧乳酸菌，但不同菌種對氧的敏感性有差異，某些菌種當有CO2存在時，對氧可以耐受[5]。亨氏管中的培養(yǎng)基是無菌無氧的，菌落無論在培養(yǎng)基表面還是內(nèi)部，都能很好的生存和繁殖，有利于科學的計數(shù)雙歧桿菌，提高雙歧桿菌檢出率的正確性。

4 結論

（1）平板涂布法、傾注平板法、亨氏管培養(yǎng)法用乳酸桿菌和雙歧桿菌檢出和計數(shù)無顯著差異。

（2）乳酸桿菌適宜用傾注平板法；雙歧桿菌適宜用亨氏管法。

[1]張銀旺. 糞便標本中雙歧桿菌定量培養(yǎng)方法的建立與評價[J]. 現(xiàn)代檢驗醫(yī)學雜志，2005，20（6）：53-54

[2]潘靈輝. 低聚木糖對斷奶仔豬生產(chǎn)性能、腸道菌群及免疫水平影響的研究[D].湖南：湖南農(nóng)業(yè)大學， 2005

[3]趙曉靜. 全營養(yǎng)保健代乳粉及甘露寡糖對犢牛代謝及生長發(fā)育研究究[D]. 河北：河北農(nóng)業(yè)大學，2005

[4]GB 4789.35-2010.國家標準食品微生物學檢驗-乳酸菌檢驗[S]

[5]邵長玲，孫寶清，魏秋芬,等. 雙歧桿菌的生理作用[J]. 中華醫(yī)藥雜志，2006，6（11）：1179-1181