洪富源,孫 芳,劉 軍,姚 建,黃一新

(1.福建醫(yī)科大學省立臨床學院,福建省立醫(yī)院腎內(nèi)科,福州 350001;2.上海市第一人民醫(yī)院腎內(nèi)科,上海 200080)

腹膜病理研究發(fā)現(xiàn),長期腹膜透析后,腹膜間皮細胞下致密膠原層進行性增厚,有相當多的證據(jù)表明長期腹膜透析后腹膜的這些改變和腹透液的生物不相容性有關(guān),而緩沖液的組成、糖、糖降解產(chǎn)物是腹透液生物相容性最關(guān)鍵性的因素[1]。長期腹膜透析后患者腹膜長期暴露在含有高糖及含有葡萄糖降解產(chǎn)物的腹透液中,導致晚期糖基化終末產(chǎn)物(advancedglycosylation end products,AGEs)的積聚,這意味著腹膜長期受到AGEs的作用。有研究發(fā)現(xiàn)腹膜基質(zhì)的主要組成成分層連蛋白的表達水平與AGEs的沉積呈明顯正相關(guān),轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)等促纖維化細胞因子在腹膜上的表達與AGEs的表達強度一致[2]。AGEs是否能夠促進腹膜間皮細胞合成細胞外基質(zhì),是否參與長期腹透的腹膜纖維化過程目前尚不清楚。

本研究中我們采用體外人腹膜間皮細胞(human peritoneal mesothelial cells,HPMC)培養(yǎng)模型,觀察晚期糖基化人血清白蛋白(AGE-HSA)對HPMC合成纖維連接蛋白(FN)和PKC活性的影響。并且應(yīng)用PKC激動劑PMA和PKC特異抑制劑Calphostin C進行干預(yù),探討PKC信號通路在AGEs促進人腹膜間皮細胞分泌細胞外基質(zhì)中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

人血清白蛋白(human serum albumin,HSA,AMRESCO產(chǎn)品),D-葡萄糖(Sigma公司),DMEM、HEPES(GIBCO公司),小牛血清(上海普飛生物公司),佛波脂(PMA,Sigma公司),Calphostin C(Sigma公司),非放射性PKC測定試劑盒(日本MBL公司),纖維連接蛋白(FN)酶聯(lián)免疫(ELISA)試劑盒(上海太陽生物技術(shù)公司),Trizol(Invitrogen公司),反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega公司),dNTP(脫氧核苷酸)、Taq DNA聚合酶(Promega公司),FN、GAPDH引物(上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司),SYBR Green I實時定量PCR試劑盒(大連寶生物TAKARA公司)。

1.2 AGE-HSA的制備

參照文獻[3],將1.75 g/L純化的HSA置于含或不含0.1 mol/L D-葡萄糖的0.4 mol/L磷酸鹽緩沖液中,37℃孵育8周。用pH 7.4磷酸鹽緩沖液透析以除去未結(jié)合的葡萄糖。以在同樣條件但不含葡萄糖的磷酸鹽緩沖液中孵育8周的HSA作為對照。體外制備的AGE-HSA經(jīng)熒光分光光度法鑒定。

1.3 細胞培養(yǎng)

人腹膜間皮細胞株(HMrSV5)由TENON醫(yī)院(法國)腎臟科腎臟病研究所Pierre RONCO教授饋贈。細胞生長于DMEM培養(yǎng)液(含10%胎牛血清,2 mmol/L的 L-谷氨酰胺)中,5%CO2、37℃條件下培養(yǎng),常規(guī)換液。以第10～11代細胞作本試驗。待細胞生長至70%～80%用于實驗。

1.4 實驗分組

A:對照組 HSA 500 μ g/ml;B:AGE-HSA 0 μ g/ml;C:AGE-HSA 100 μ g/ml;D:AGE-HSA 500 μ g/ml;E:AGE-HSA 1 000 μ g/ml;F:PMA 80 nmol/L;G:PMA 100 nmol/L孵育細胞 24 h后 +HSA 500 μ g/ml;H:PMA 100 nmol/L孵育細胞24 h后+AGE-HSA 500 μ g/ml;I:PMA 100 nmol/L孵育細胞24 h后+PMA 80 nmol/L;J:HSA 500 μ g/ml+calphostin C 100 nmol/L;K:AGE-HSA 500 μ g/ml+calphostin C 100 nmol/L;L:PMA 80 nmol/L+calphostin C 100 nmol/L。

1.5 HPMC細胞PKC活性測定

依照試劑盒說明進行細胞PKC提取及活性測定。各處理因素作用后,吸棄培養(yǎng)液,細胞用預(yù)冷的HBSS洗3次,用細胞刮刮下細胞,預(yù)冷的HBSS再洗2次,加入樣品緩沖液,超聲波細胞破碎儀破碎細胞4次,每次5 s,63 000×g 4℃離心90 min,沉淀部分用含1.0%Triton-X-100的樣品緩沖液溶解,在4℃的搖床上搖動30 min,勻質(zhì)液用樣品緩沖液稀釋到Triton-X-100的終濃度為0.5%,63 000×g離心15 min,上清液用作胞膜PKC激酶樣品。用ELISA法測定各組PKC活性,以Bio-Rad550型酶標儀測定A490反映PKC活性大小。實驗均設(shè)復孔,重復3次,取其均值。

1.6 熒光實時定量PCR

RNA抽提和逆轉(zhuǎn)錄按Trizol試劑說明書抽提不同組HPMC總RNA。按標準步驟進行逆轉(zhuǎn)錄,所得cDNA進行下步實驗。Real-time PCR反應(yīng)總體系25 μ l,包括雙蒸水 9.5 μ l,cDNA 2 μ l,SYBR green realtime PCR master mix 12.5 μ l,上下游引物 各 0.5 μ l。FN 正鏈引物 5′AATATCTCGGTGCCATTTGC3′;負鏈引物 5′AAAGGCATGAAGCACTCAAT3′GAPDH 正鏈引物5′CAGGGCTGCTTTTAC3′;負鏈引物 5′GGGTGGAATCATATTGG3′。FN反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性 30 s,隨后40循環(huán),包括95℃變性5 s,60℃退火并延伸30 s。每個基因設(shè)3復孔,實驗重復3次。采用△△Ct=(Ct目標基因-Ct內(nèi)標)已處理-(Ct目的基因-Ct內(nèi)標)未處理,檢測樣品經(jīng)刺激后,其目的基因表達量相對于樣品原始狀態(tài)分別稱為已處理樣品和未處理樣品。首先使用內(nèi)標基因GAPDH對模板進行均一化處理,對于未處理樣品△△Ct=0,而20=1,所以未處理樣品的倍數(shù)變化為l,而對于已處理樣品相對于對照樣品的基因表達的倍數(shù)為 2-△△Ct,故2-△△Ct即為半定量指標。

1.7 ELISA方法檢測細胞上清液中纖維連接蛋白的分泌

以1×105cells/well細胞密度接種24孔板,細胞80%～90%融合時換無血清培養(yǎng)基孵育24h使細胞同步化,加入上述各實驗分組孵育細胞24 h,收集細胞上清液,以4℃,3000 r/min離心5min,棄細胞碎片,-80℃保存待測,同時對每孔細胞以胰蛋白酶消化后進行細胞計數(shù)。設(shè)6個復孔,ELISA檢測嚴格按照試劑盒操作,所得數(shù)據(jù)以細胞數(shù)進行校正。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 AGE-HSA對人腹膜間皮細胞PKC活性的影響

2.1.1 AGE-HSA作用的時效關(guān)系 以AGE-HSA 500 μ g/ml作用 HPMC 0～ 120 min(圖 1),AGE-HSA作用15 min,即可使胞膜PKC活性升高。PKC活性在60 min達最高值,是刺激前的3.340倍。120 min時PKC活性還未完全降至刺激前水平,與對照組相比差異有顯著意義(P＜0.05)。

Fig.1 Time-dependent manners of AGE-HSA on PKC activitiesin HPMC

2.1.2 AGE-HSA作用的量效關(guān)系 HSA(500 μ g/ml)AGE-HSA(100 μ g/ml、500 μ g/ml、1 000 μ g/ml)作用60 min對胞膜PKC活性影響結(jié)果顯示:100 μ g/ml AGE-HSA對胞膜PKC活性無明顯影響,隨AGEHSA濃度增加PKC活性逐漸增強(P＜0.05,圖2)。

Fig.2 Dose-dependent manners of AGE-HSA on PKC activitiesin HPMC

2.2 AGE-HSA對人腹膜間皮細胞纖維連接蛋白mRNA的影響

AGE-HSA(0、100、500、1 000 ug/ml)作用HPMC 8 h的量效關(guān)系圖可知,隨著AGE-HSA刺激量的增加,HPMC的FN mRNA表達量也增加,呈量效關(guān)系;AGE-HSA 500 μ g/ml就 可以明 顯促進 FN mRNA 表達,是空白對照組的(3.184±0.736)倍,1 000 μ g/ml AGE-HSA可使FN mRNA表達量進一步增加為是空白對照組的(4.016±1.216)倍(P＜0.01,圖3)。500 μ g/ml AGE-HSA 作用(0、4、8、12 h)的時效關(guān)系圖顯示,HPMC的FN mRNA表達量在8 h達到最大值,并至少持續(xù)到12 h,為空白對照組的(2.014±0.567)倍(P＜0.01,圖4)。

Fig.3 Dose-dependent manners of AGE-HSA on FN mR NA expression of HPMC

Fig.4 Time-dependent manners of AGE-HSA on FN mR NA expression of HPMC

2.3 AGE-HSA對人腹膜間皮細胞合成和分泌纖維連接蛋白的影響

500 μ g/ml AGE-HSA刺激細胞 24 h后,FN合成和分泌明顯增加,為(128.8±8.6)ng/(ml·106cells)(P＜0.05),并呈現(xiàn)良好的劑量依賴效應(yīng),1 000 μ g/ml AGE-HSA可使FN的合成和分泌增加至(153.5±10.7)ng/(ml·106cells)(P＜0.01,圖 5)。

2.4 蛋白激酶C(PKC)參與AGE-HSA誘導人腹膜間皮細胞合成和分泌纖維連接蛋白

500 μ g/ml AGE-HSA 和 80 nmol/L PMA 能夠促進HPMC分泌細胞ECM 成份FN(P＜0.05),用PKC激動劑佛波脂(PMA 100 nmol/L)孵育24 h耗竭細胞內(nèi)PKC后,AGE-HSA、PMA不能促進HPMC分泌FN,PKC特異抑制劑calphostin C 100 nmol/L可以抑制AGE-HSA誘導的FN分泌。這說明PKC途徑參與了AGE-HSA促進HPMC分泌FN(圖6)。

Fig.5 HSA and AGE-HSA on FN secretions of HPMC

Fig.6 Effects of PKC on the AGE-HSA-stimulated secretions of FN in HPMC HSA 500 μ g/ml,AGE-HSA 500 μ g/ml,PMA 100 nmol/L,Calphostin C 100 nmol/L

3 討論

腹膜透析,特別是持續(xù)性不臥床腹膜透析,是一種有效治療終末期腎臟疾病患者的方法。但近年來大量實驗和臨床研究發(fā)現(xiàn),長期和反復使用以葡萄糖為基礎(chǔ)的腹透液進行腹膜透析患者會出現(xiàn)腹膜纖維化,超濾失敗,最終放棄腹膜透析[4]。腹透相關(guān)性腹膜纖維化的主要組織學改變是腹膜間皮細胞層完整性破壞和間皮下基質(zhì)成分堆積兩方面。在基礎(chǔ)狀態(tài)下,人腹膜間皮細胞能夠合成和分泌各種細胞外基質(zhì)蛋白,如纖維連接蛋白、層粘連蛋白、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原、Ⅳ型膠原等[5]。纖維連接蛋白(FN)是一種間質(zhì)型的基質(zhì)成分,其生成的增多提示間皮細胞細胞外基質(zhì)分泌增加[6]。長期腹膜透析后,有大量的AGEs沉積腹膜上。在體內(nèi),腹膜上AGEs本身也可能刺激間皮細胞基質(zhì)的表達,如腹膜基質(zhì)的主要組成成分層連蛋白的表達水平與AGEs的沉積呈明顯正相關(guān),AGEs誘導腹膜間皮細胞合成基質(zhì)增加,從而造成基質(zhì)蛋白大量堆積或基質(zhì)成分被AGEs修飾而發(fā)生結(jié)構(gòu)改變,導致腹膜硬化。而且沉積于腹膜的AGEs還可刺激單核巨噬細胞分泌TNF-α、IL-1、TGF-β、PDGF等,從而促進細胞外基質(zhì)合成,導致腹膜纖維化[2]。我們在體外的研究發(fā)現(xiàn):AGE-HSA以時間、濃度依賴的方式促進HPMC的細胞外基質(zhì)成份FN mRNA和蛋白的表達。

然而,AGEs促進HPMC纖維連接蛋白合成增加的具體機制尚不清楚。Ha H等發(fā)現(xiàn),細胞內(nèi)PKC活化后,HPMC合成和分泌FN也隨之增加,因此作者認為PKC途徑參與了HPMC合成和分泌FN的過程[7,8]。PKC是一個至少由12種絲氨酸/蘇氨酸激酶的同型異構(gòu)體組成的家族,它對細胞的許多過程(從基本的、自主的細胞功能到生物功能如記憶)都有調(diào)節(jié)作用。在未受激活的細胞中,PKC存在于細胞質(zhì)中活性很低,在與Ca2+、二?；视偷燃觿┙Y(jié)合后即發(fā)生酶構(gòu)象變化,PKC從胞漿移到胞膜或核內(nèi),從而被激活,因此本研究以胞膜的PKC作為酶活性的標志。我們的研究發(fā)現(xiàn):隨AGE-HSA濃度增加,PKC活性呈劑量依賴關(guān)系,500 μ g/ml AGEHSA作用于HPMC可迅速激活PKC,活性高峰在60 min,先用PKC激動劑PMA耗竭細胞內(nèi)PKC后、或者用PKC特異抑制劑calphostin C后,HPMC合成和分泌FN表達減少了。因此我們認為,AGEs可能通過活化PKC,促進HPMC合成和分泌FN。目前已經(jīng)證實活化的PKC可誘導原癌基因c-fos和c-jun的轉(zhuǎn)錄,而c-fos和c-jun通過AP-1鏈接位置基因轉(zhuǎn)錄,FN的啟動區(qū)含有AP-1鏈接交感序列,故認為活化的PKC誘導AP-1可能是AGE-HSA上調(diào)FN合成的一種機制[7]。Lee BH等人還發(fā)現(xiàn)PMA誘導分泌的FN的主要基因序列位于-69和+136[9]。PKC活化后不僅促進FN的表達,在腎小球系膜細胞還會增加Ⅳ型膠原的轉(zhuǎn)錄活性。AGEs除了可以通過PKC途徑合成FN外,在對大鼠系膜細胞的研究發(fā)現(xiàn),AGE-BSA和CML-BSA通過活化TGF-beta-Smad信號通路促進FN合成[10]。

總之,AGEs可能部分通過激活人腹膜間皮細胞中的PKC,促進人腹膜間皮細胞合成和分泌FN,從而引起腹膜纖維化,最終導致腹膜失超濾。

[1]Davies S J,Mushahar L,Yu Z,et al.Determinants of peri-toneal membrane function over time[J].Semin Nephrol,2011,31(2):172-182.

[2]Boulanger E,Daroux M.Peritoneal aging during PD:implication of RAGE,the receptor for AGEs[J].Nefrologia,2008,28(Suppl 6):5-10.

[3]Takeuchi M,Bucala R,SuzukiT,et al.Neurotoxicity of advanced glycation end-products for cultured cortical neurons [J].J Neuropathol Exp Neurol,2000,59(12):1094-1095.

[4]Kim Y L.Update on mechanisms of ultrafiltration failure[J].Perit Dial Int,2009,29(Suppl 2):S123-127.

[5]Kim J J,Li JJ,Kim K S,et al.High glucose decreases collagenase expression and increases TIMP expression in cultured human peritoneal mesothelial cells[J].Nephrol Dial Transplant,2008,23(2):534-541.

[6]Yokoyama Y,Masaki T,Kiribayashi K,et al.15-Deoxy-Delta12,14-prostaglandin J2 inhibits angiotensin II-induced fibronectin expressionviahepatocyte growth factor induction in human peritoneal mesothelial cells[J].Ther Apher Dial,2010,14(1):43-51.

[7]Ha H,Yu M R,Lee H B.High glucose-induced PKC activation mediates TGF-beta 1 and fibronectin synthesis by peritoneal mesothelial cells[J].Kidney Int,2001,59(2):463-470.

[8]Lee H B,YuM R,Song JS,et al.Reactive oxygen species amplify protein kinase C signaling in high glucose-induced fibronectin expression by human peritoneal mesothelial cells[J].Kidney Int,2004,65(4):1170-1179.

[9]Lee BH,Kim M S,Rhew J H,et al.Transcriptional regulation of fibronectin gene by phorbol myristate acetate in hepatoma cells:a negative role for NF-kappaB[J].J Cell Biochem,2000,76(3):437-451.

[10]Fukami K,Ueda S,Yamagishi S,et al.AGEs activate mesangial TGF-beta-Smad signalingviaan angiotensin II type I receptor interaction[J].Kidney Int,2004,66(6):2137-2147.