馬 晶,丁誠實,余 鴻

(1.棗莊職業(yè)學(xué)院醫(yī)學(xué)系,山東棗莊 277800;2.棗莊學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院,山東 棗莊 277160;3.瀘州醫(yī)學(xué)院 組胚教研室,四川 瀘州 646000)

當(dāng)歸是國藥精華,其味甘而重,專能補(bǔ)血;其氣輕而辛,又能行血。由于其作用廣泛、副作用小,使其在婦產(chǎn)科臨床上具有獨特的優(yōu)勢。研究表明當(dāng)歸可以減弱低氧時神經(jīng)元的變性[1],但其如何對抗神經(jīng)系統(tǒng)的損傷機(jī)制還有待研究。近年來研究發(fā)現(xiàn),血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)具有類似血管源性的神經(jīng)保護(hù)和神經(jīng)營養(yǎng)作用,但VEGF是否也參與宮內(nèi)低氧新生大鼠的神經(jīng)系統(tǒng)的改變目前尚不確定。本實驗在前期的研究基礎(chǔ)[2]上進(jìn)一步延長低氧時間(低氧5 d),觀察神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的變化,研究當(dāng)歸對其是否有干預(yù)作用并探討其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

SD雌、雄大鼠各15只(220～260 g)由瀘州醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供(一級合格動物,許可證號:川實動管質(zhì)第17號);大鼠神經(jīng)特異性烯醇化酶(neurone specific enolase,NSE)mR NA、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)mR NA、VEGF mRNA原位雜交檢測試劑盒,3,3'-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒購自武漢博士德生物工程公司;原位雜交用焦碳酸二乙酯(DEPC)由第四軍醫(yī)大學(xué)試劑公司提供;250 g/L的當(dāng)歸注射液(購自武漢大學(xué)中南醫(yī)院,生產(chǎn)批號:070823)。三氣培養(yǎng)箱購自美國REVCO COMPANY;切片機(jī)為德國萊卡產(chǎn)品;OLYMPUS Ax-70顯微成像系統(tǒng)購自日本OLYMPUS光學(xué)儀器有限公司;Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)為Media Cybernetics公司產(chǎn)品。

1.2 動物及分組

雌大鼠分別與雄大鼠合籠配種,次日晨見陰栓記為大鼠懷孕0 d,孕鼠隨機(jī)均分為對照組、低氧組和當(dāng)歸組。

1.3 宮內(nèi)低氧動物模型制備

參照本實驗小組前期制作的宮內(nèi)低氧模型[3],但延長低氧時間。當(dāng)歸組孕鼠自孕第l4天開始,每天下午2∶00經(jīng)尾靜脈注射250 g/L的當(dāng)歸注射液8 ml/kg(孕第14～20天,連續(xù)7 d),1 h后放入設(shè)置好的三氣培養(yǎng)箱(氧體積分?jǐn)?shù)130ml/L,溫度25℃ ,二氧化碳體積分?jǐn)?shù)0.4～0.6ml/L)內(nèi)低氧2 h,連續(xù)低氧5 d(孕第14～18天),第 19、20天仍給予當(dāng)歸注射液,但不低氧。低氧組用9 g/L鹽水代替當(dāng)歸注射液,其余同當(dāng)歸組。對照組不低氧,余同低氧組。

1.4 取材、石蠟切片與原位雜交

每只孕鼠分娩當(dāng)天隨機(jī)選取新生大鼠4只,每組得新生鼠20只,取新生大鼠腦、40 g/L多聚甲醛固定60 min、石蠟包埋(試劑中含1 ml/L的DEPC)、海馬冠狀切面切片。切片作NSE mRNA、GFAP mRNA、VEGF mRNA 原位雜交,切片常規(guī)脫水、透明、封片。每張切片在400倍下用OLYMPUS Ax-70顯微成像系統(tǒng)對海馬CA3區(qū)拍照。

1.5 圖像分析

采用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng),分析原位雜交圖并統(tǒng)計其積分光密度(IOD)值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 16.0軟件包完成數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,組間比較用LSD法檢驗。

2 結(jié)果

2.1 NSE mRNA原位雜交染色結(jié)果

NSE mRNA原位雜交反應(yīng)陽性細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)被染為棕黃色,胞質(zhì)中央為卵圓形或圓形空泡。主要分布錐體細(xì)胞層、分子層。低氧組NSE mRNA原位雜交反應(yīng)陽性細(xì)胞的分布與對照組相似,但陽性細(xì)胞較對照組染色減弱、數(shù)量減少,其積分光密度值均減小(P＜0.05)。當(dāng)歸組NSE mRNA原位雜交反應(yīng)陽性細(xì)胞分布與對照組相似,但較低氧組染色增強(qiáng)、數(shù)量增多,其積分光密度值增大(P＜0.05,圖1,表1)。

2.2 各組新生鼠海馬CA3區(qū)GFAP mRNA原位雜交結(jié)果

GFAP mRNA原位雜交陽性細(xì)胞胞質(zhì)染為棕黃色,主要分布于錐體細(xì)胞層、分子層和多形細(xì)胞層。對照組陽性細(xì)胞淺染,數(shù)量少。低氧組陽性細(xì)胞染色深,數(shù)量較對照組增多,尤其以分子層變化明顯。當(dāng)歸組陽性細(xì)胞較低氧組染色明顯減弱,數(shù)量明顯減少(P＜0.05,圖2,表1)。

2.3 各組新生鼠海馬CA3區(qū)VEGF mRNA原位雜交結(jié)果

VEGF mRNA原位雜交陽性細(xì)胞胞質(zhì)染為棕黃色,陽性細(xì)胞主要分布于錐體細(xì)胞層,細(xì)胞大而圓。對照組分布較集中,陽性細(xì)胞染色較淺。低氧組陽性細(xì)胞較對照組染色加深,數(shù)量增多,分子層和多形細(xì)胞層出現(xiàn)較多陽性細(xì)胞。當(dāng)歸組陽性細(xì)胞較低氧組染色加深,陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增多,尤以分子層最為明顯(P＜0.05,圖3,表1)。

Fig.1 NSE mRNA positive cells in hippocampal CA3 area of neonatal rat(ISH ×400)

Fig.2 GFAP mR NA positive cells in hippocampal CA3 area of neonatal rat(ISH ×400)

Fig.3 VEGF mRNA positive cells in hippocampal CA3 area of neonatal rat(ISH ×400)

Tab.1 IOD of NSE mRNA,GFAP mRNA,VEGF mRNA positive cell(±s,n=20)

Tab.1 IOD of NSE mRNA,GFAP mRNA,VEGF mRNA positive cell(±s,n=20)

NSE:Neurone specific enolase;GFAP:Glial fibrillary acidic protein;VEGF:Vascular endothelial growth factor;IOD:Integrated optical density*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs hypoxia

Group NSE GFAP VEGF Control 83.85±5.52 7.24±1.78 63.62±6.08 Hypoxia 52.18±4.98*16.78±4.02*75.80±5.55*Angelica 72.25±3.29*#9.78±2.79#89.15±9.90*#

3 討論

本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),宮內(nèi)低氧(130ml/L)連續(xù)5d(2 h/d)后海馬CA3區(qū)NSE mRNA原位雜交陽性物質(zhì)表達(dá)比對照組明顯減弱,陽性細(xì)胞減少,積分光密度值減小,提示胚胎海馬的神經(jīng)元出現(xiàn)了壞死和/或凋亡,導(dǎo)致神經(jīng)元數(shù)量減少,低氧對神經(jīng)元起到了損傷作用。本實驗原位雜交結(jié)果顯示低氧組海馬CA3區(qū)GFAP mRNA陽性細(xì)胞數(shù)量和染色均較對照組明顯增多,說明低氧刺激了該區(qū)膠質(zhì)細(xì)胞增生,其可能與膠質(zhì)細(xì)胞參與了神經(jīng)系統(tǒng)的修復(fù)相關(guān),是神經(jīng)系統(tǒng)對低氧的適應(yīng)性反應(yīng)。而當(dāng)歸組GFAP mRNA較低氧組減少,說明當(dāng)歸在一定程度上減弱了由于低氧導(dǎo)致的該區(qū)膠質(zhì)細(xì)胞的增生。在神經(jīng)系統(tǒng)中,膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量是神經(jīng)元的數(shù)十倍,而神經(jīng)元損傷時,膠質(zhì)細(xì)胞增生、肥大,形成膠質(zhì)瘢痕予以修復(fù)損傷區(qū)域。結(jié)合本實驗結(jié)果,可見膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)系統(tǒng)低氧修復(fù)時起了重要作用。實驗中低氧組VEGF mRNA較對照組增多,當(dāng)歸組VEGF mRNA較低氧組進(jìn)一步增多,說明低氧可上調(diào)VEGF mRNA的表達(dá),而當(dāng)歸注射液可進(jìn)一步上調(diào)VEGF mR NA的表達(dá)。結(jié)合NSE mRNA結(jié)果分析,說明低氧后VEGF mRNA的上調(diào)表達(dá)所產(chǎn)生的抗凋亡等神經(jīng)保護(hù)作用還不足以抵抗由于持續(xù)5 d(2 h/d)的宮內(nèi)低氧(130 ml/L)導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷作用,從而使低氧組NSE mRNA的IOD值較對照組減小;而當(dāng)使用當(dāng)歸注射液后使VEGF mRNA的表達(dá)進(jìn)一步上調(diào),從而進(jìn)一步增強(qiáng)了VEGF的神經(jīng)保護(hù)作用,使當(dāng)歸組NSE mRNA的IOD值較低氧組增大。有研究表明VEGF大量表達(dá)有利于大腦損傷的修復(fù)、功能的完善,其機(jī)制可能與促進(jìn)血管發(fā)生、保護(hù)神經(jīng)組織、促進(jìn)膠質(zhì)細(xì)胞增生及修復(fù)等作用密切相關(guān);大量的VEGF表達(dá)增加了腦血管通透性,使用VEGF受體阻滯劑反而減輕了腦組織的急性興奮性損傷[4],這可能和VEGF的量及出現(xiàn)在損傷后的時間有密切關(guān)系。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)歸屬根中提取的前胡素、前胡醇衍生物等具有高活性的神經(jīng)保護(hù)作用,通過多種機(jī)制減少氧化應(yīng)激引起的細(xì)胞損傷。結(jié)合本實驗結(jié)果,推測低氧刺激產(chǎn)生的神經(jīng)保護(hù)作用可能與當(dāng)歸對內(nèi)源性VEGF的激活有關(guān)。

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