包曉辰,方以群,馬 駿,孟 淼

(海軍醫(yī)學研究所,上海 200433)

隨著深海石油及水下作業(yè)的開發(fā),潛水在經(jīng)濟建設(shè)中的作用日益突出。但是潛水減壓病限制了應(yīng)用潛水技術(shù)的發(fā)展。減壓病(decompression sickness,DCS)是機體在某一氣壓環(huán)境下,暴露一定時間后,由于減壓不當導致機體組織內(nèi)原來溶解的惰性氣體游離為氣相,形成氣泡,從而導致的一系列病理反應(yīng)的疾病[1]。目前對減壓病的發(fā)病機理尚未完全了解,有文獻認為血管內(nèi)皮屏障的破壞、粘附分子及炎性介質(zhì)的上調(diào)可能在減壓病發(fā)病中起著重要作用[2]。為了解減壓病時血管內(nèi)皮屏障通透性及粘附分子的表達改變,我們設(shè)計了本實驗。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

70只健康雄性SD大鼠購自上海西普爾畢凱實驗動物有限公司,平均體重250 g,海軍醫(yī)學研究所動物飼養(yǎng)中心飼養(yǎng)。觀察和檢疫一周正常后進行實驗。

1.2 主要試劑

大鼠種屬特異性細胞間粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)、E-選擇素(E-selectin)、主要組織相容性復合體-II(major histocompatibility complex class II molecule,MHC-II)抗體購自美國Santa Cruze公司。Evans Blue溶液及甲酰胺購自美國sigma公司。ABC試劑盒及DAB顯色試劑盒購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.3 急性減壓病大鼠模型建立及評價

70只雄性 SD大鼠,隨機分為四組:對照組、減壓后30 min觀測組、減壓后6 h觀測組、減壓后24 h觀測組。減壓組大鼠置于加壓艙內(nèi),艙底鋪設(shè)新鮮鈉石灰,壓縮空氣在3 min內(nèi)勻速加壓至0.7 MPa,停留60 min后,3 min內(nèi)快速減壓出艙。期間每隔20 min通風一次,每次1 min,保持艙內(nèi)氧濃度在19%以上,二氧化碳濃度在相當于常壓下的0.5%以下。出艙后觀察急性減壓病的癥狀,評價包括:行走困難、不正常的呼吸、前/后肢癱瘓及死亡。對照組大鼠也置于加壓艙內(nèi),在1ATA下保持1 h。減壓后30 min取出現(xiàn)減壓病癥狀大鼠及對照組大鼠的肺、肝、腦組織,甲醛溶液固定、石蠟包埋、切片、HE染色后觀察病理變化。

1.4 肺血管滲透性測定

在減壓后6 h、24 h前30 min,每組取5只大鼠,尾靜脈注射2%evans blue溶液(20 mg/kg)。30 min后,生理鹽水進行灌注,取肺組織,觀測組織藍染程度。肺組織勻漿后溶于2倍體積的甲酰胺中,60℃孵育16 h后,5 000×g離心30 min,取上清液100 μ l加入96孔板中,分光光度計吸收波長620 nm分析;OD650/g(肺組織重量)的比值可用來衡量體內(nèi)血管的滲透性。

1.5 免疫組化測定肺組織粘附分子表達

在減壓后 30 min、6 h、24 h,每組取 5只大鼠,1%戊巴比妥鈉麻醉后,生理鹽水灌注后,4%多聚甲醛灌注固定。取肺組織,后固定1.5 h,10%蔗糖浸泡24 h,組織在恒冷箱切片機切14 μ m的切片。分別加入下列一抗ICAM-1(1∶25)、E-selectin(1∶250)、MHC-II(1∶100),4℃孵育 24 h,PBS沖洗后,加入種屬特異性二抗(1∶200),室溫孵育3～4 h,加入AB混合液后,室溫孵育3 h,DAB顯色、脫水、透明、封片。光鏡下觀測陽性表達率。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 急性減壓病大鼠模型的建立

大鼠在不安全減壓后均出現(xiàn)懶動、反應(yīng)遲鈍、呼吸急促的癥狀,少數(shù)大鼠出現(xiàn)肢體癱瘓。這些癥狀在減壓后30 min內(nèi)最為顯著,其中有約50%的大鼠在減壓后15 min內(nèi)出現(xiàn)呼吸急促、抽搐、死亡;10%的大鼠出現(xiàn)癱瘓、呼吸急促,在出艙后12 h內(nèi)死亡;其余大鼠在減壓后出現(xiàn)呼吸急促、懶動、豎毛等癥狀,在2 h內(nèi)恢復。

2.2 急性減壓病大鼠的組織病理表現(xiàn)

組織病理顯示:出現(xiàn)急性減壓病癥狀大鼠的肺、肝及大腦皮層均出現(xiàn)不同程度的病變:肺臟組織明顯充血水腫,肺泡結(jié)構(gòu)破壞,肺泡間隔增厚,支氣管旁大量炎性細胞侵潤;肝臟呈現(xiàn)顯著的淤血,但肝小葉結(jié)構(gòu)完整;大腦皮質(zhì)呈現(xiàn)輕微的水腫,軟腦膜有少量的淤血,余無異常表現(xiàn)(圖1)。

Fig.1 Tissue pathology of the lung,liver and cerebral cortex of rats sufferedwith DCS(HE stain ×200)

2.3 急性減壓病大鼠肺組織血管滲透性測定

Evans blue可以與血中白蛋白結(jié)合,正常生理狀態(tài)的血管內(nèi)皮作為一道屏障可以阻礙其與血中白蛋白結(jié)合,當血管內(nèi)皮損傷時,Evans blue因可和滲漏出的白蛋白結(jié)合,使組織染色。因而被廣泛用于評估體內(nèi)外血管滲透性。在本實驗中,我們應(yīng)用該染色方法探討急性減壓病時大鼠肺血管滲透性的改變。結(jié)果發(fā)現(xiàn):急性減壓病大鼠肺組織的藍染程度顯著增加,減壓后6 h顯著,24 h仍藍染明顯(圖2A)。定量分析發(fā)現(xiàn),相對于對照組的OD620值(6.53±1.32),減壓后 6 h及 24 h肺組織中Evans blue的含量顯著增加(OD620值分別為12.78±0.69,10.34±1.27,P＜0.05,圖2B)。

Fig.2 Vascular leakage in the lungs was assessed in SD rats post decompression(±s,n=5)

2.4 急性減壓病可引起肺組織粘附分子的表達上調(diào)

E-selectin表達在減壓后30 min及6 h在肺組織中表達上調(diào),在減壓后24 h恢復至接近基值;ICAM-1在減壓后6 h在肺組織中表達上調(diào),在減壓后24 h仍上調(diào)顯著;MHC-II在減壓后6 h表達上調(diào)明顯,24 h回復基值(表1)。

Tab.1 Immunostaining for E-selectin,ICAM-1 and MHC-II protein in the lung of rats post decompression(IOD value,±s,n=5)

Tab.1 Immunostaining for E-selectin,ICAM-1 and MHC-II protein in the lung of rats post decompression(IOD value,±s,n=5)

IOD:Mean area×mean density;RD:Rapid decompression*P＜0.05 vs control group

Group ICAM-1 E-selectin MHC-II Control 19.37±5.57 20.51±7.53 5.58±2.90 30 min post RD 21.06±5.91 125.79±10.53*7.66±3.01 6 h post RD 42.28±4.27*128.68±10.99*11.89±3.05*24 h post RD 54.59±8.96*38.75±19.97 9.23±4.28

3 討論

Eckmann等報導不安全減壓產(chǎn)生的大量氣泡可聚集在血管,導致血管阻塞及增加內(nèi)皮細胞間的縫隙連接。血管長時間的阻塞,可導致內(nèi)皮組織缺血缺氧,內(nèi)皮細胞激活,血管內(nèi)的炎性細胞聚集至內(nèi)皮細胞表面,釋放氧自由基、蛋白酶,進一步損害內(nèi)皮組織,激活炎癥介質(zhì)的釋放,使機體呈現(xiàn)一前致炎性狀態(tài)[3-4]。因此Madden等提出假設(shè):氣泡導致的,細胞因子介導的內(nèi)皮損傷可能是急性減壓病的發(fā)病原因之一[5]。

內(nèi)皮細胞的受損可導致細胞激活,內(nèi)皮細胞激活狀態(tài)下可誘導粘附分子的表達。這些內(nèi)皮細胞激活標記可表達在不同階段。如P-selectin在激活后幾分鐘內(nèi)就可出現(xiàn),從而促進細胞粘附的進展,而E-selectin在激活后4～6 h達到高峰。ICAM-1及VCAM-1的增高可持續(xù)數(shù)天[6]。因為DCS表現(xiàn)出類似于系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)的癥狀[7],因此我們推測不安全減壓后機體產(chǎn)生的細胞因子可介導內(nèi)皮細胞的激活,引起粘附分子表達上調(diào)。我們在本部分實驗中采用免疫組化的方式檢測肺組織中 E-selectin、ICAM-1及MHC-II的表達變化。之所以選擇了肺組織,因為肺是減壓病的靶器官,是靜脈氣泡的早期過濾器,因為壓力比體循環(huán)中低,因此更容易在減壓過程中形成氣泡。Nyquist等報道重型減壓病時肺組織是炎性細胞聚集最為顯著的地方,也支持這一觀點[8]。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)肺組織中粘附分子表達上調(diào),且在減壓后30 min至6 h最為顯著。其中,ICAM-1表達在減壓后6 h在肺組織中表達上調(diào),在減壓后24 h仍上調(diào)顯著。E-selectin在減壓后30 min及6 h在肺組織中表達上調(diào),在減壓后24 h恢復至接近基質(zhì)。MHC-II在減壓后6 h表達上調(diào)明顯,24 h后回復基值。這和上述文獻結(jié)果相符合。ICAM-1在正常狀態(tài)下極微量的表達于內(nèi)皮細胞表面,在TNF-α和IFN-γ的刺激下,血管內(nèi)皮細胞表面的ICAM-1可增高,且增高可持續(xù)數(shù)天[9],因此,在本實驗中,ICAM-1的表達在減壓后24 h仍增高明顯。ICAM-1激活時可和白細胞表面的LFA-1受體相結(jié)合,從而介導白細胞和內(nèi)皮細胞的粘附。E-selectin只表達在經(jīng)炎癥因子激活的內(nèi)皮細胞表面,可促進白細胞粘附至受損的內(nèi)皮細胞上,可被TNF-α和IL-1所激活。E-selectin在激活后4～6 h達到高峰,在本實驗中,我們發(fā)現(xiàn)E-selectin在減壓后6 h達高峰。IFN-γ可激活血管內(nèi)皮細胞表面表達MHC-II類分子,介導白細胞和內(nèi)皮細胞的結(jié)合[8],本實驗中,MHC-II表達在減壓后6 h上調(diào)明顯。

粘附分子的增高趨勢和組織的病理表現(xiàn)及大鼠的臨床癥狀呈現(xiàn)一致性。組織病理顯示:肺、肝及大腦皮質(zhì)均在減壓后30 min內(nèi)病損最為顯著,表現(xiàn)為肺組織的充血水腫、肺泡結(jié)構(gòu)的消失;肝臟淤血;大腦皮質(zhì)的水腫及淤血。該現(xiàn)象和我們前期發(fā)現(xiàn)的急性減壓病兔的病理表現(xiàn)相一致,提示快速減壓后1 h為重型減壓病搶救的關(guān)鍵時期[10]。同時提示我們,除了肺組織是減壓病的靶器官之外,肝臟及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷也較明顯,因此在后期的實驗中,應(yīng)對減壓病導致的其它系統(tǒng)的損傷進行進一步研究。

為更進一步檢測減壓病時肺血管內(nèi)皮屏障的破壞,在本實驗中,我們也采用了evans blue染色法。結(jié)果發(fā)現(xiàn)急性減壓病大鼠肺組織的血管滲透性明顯增加,即使在減壓后24 h,大鼠無明顯癥狀體征時,肺臟血管滲透性仍顯著增加。該現(xiàn)象提示肺血管內(nèi)皮屏障顯著破壞,同時提示即使是無明顯癥狀的大鼠,肺組織的損傷還是存在的。

因此,根據(jù)上述實驗結(jié)果,我們認為不安全減壓產(chǎn)生的大量氣泡,可導致血管內(nèi)皮受損,受損的血管內(nèi)皮,可誘導內(nèi)皮細胞粘附分子表達上調(diào),白細胞粘附至內(nèi)皮細胞表面,進一步損傷血管內(nèi)皮屏障。

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