奶粉基因組DNA不同提取方法的比較

徐偉麗，馬 鶯

(哈爾濱工業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，150090哈爾濱)

近年來，分子生物學(xué)技術(shù)已成功用于物種鑒別，其中的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)更是廣泛應(yīng)用于食品原料物種鑒別、飼料中動(dòng)物源性成分的鑒別和摻偽檢驗(yàn).核酸分子是PCR技術(shù)應(yīng)用的主要對象，所以，DNA的分離與提取是該項(xiàng)技術(shù)的重要前提［1-4］.反芻動(dòng)物奶中含有體細(xì)胞(包括白細(xì)胞和乳腺上皮細(xì)胞).有研究表明，這些細(xì)胞可以作為DNA來源用于PCR擴(kuò)增特定靶序列的區(qū)別動(dòng)物物種［5-9］.目前，對于植物和動(dòng)物組織全基因組DNA的提取方法已有不少研究和報(bào)道［10-19］.奶粉不同于一般的植物和動(dòng)物組織材料，適宜的提取方法也不同.能夠更有效地提取更高質(zhì)量的奶粉基因組DNA方法的篩選，是一個(gè)需要進(jìn)一步探討的問題.

目前關(guān)于奶粉中全基因DNA的提取國外尚無報(bào)道，國內(nèi)僅有岳巧云等［20］采用 Plant DNA Wizard純化試劑盒(Promega公司)提取奶粉中的基因組DNA用于實(shí)時(shí)熒光PCR法對奶粉中的豆粉進(jìn)行檢測.此方法具有費(fèi)用高、費(fèi)時(shí)、對操作技能有較高要求等缺點(diǎn)，因此，需要發(fā)展簡單、快速、成本低的奶粉基因組DNA提取方法.而采用不同方法提取奶粉基因組DNA的比較研究目前國內(nèi)外尚無報(bào)道.本實(shí)驗(yàn)選擇熱解法、異丙醇沉淀法、CTAB(cetyl-trimethyl-ammonium bromide，十六烷基三甲基溴化銨)法、SDS(sodium dodecyl sulphate，十二烷基硫酸鈉)法和高鹽低pH值法、異硫氰酸胍法6種方法，以市售奶粉為材料，進(jìn)行基因組DNA提取，通過提取效果比較，探討適用于奶粉的基因組DNA提取方法.為乳品安全中利用PCR技術(shù)進(jìn)行快速檢測找到簡單、穩(wěn)定、優(yōu)質(zhì)的DNA提取方法.

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

全脂奶粉購于超市，于陰涼干燥處儲(chǔ)存?zhèn)溆?開封后分裝，于4℃保存.

1.2 試劑

Tris Base、EDTANa2、SDS、CTAB、異硫氰酸胍、Triton X-100、Tris平衡酚、瓊脂糖 G-10、氯仿、異戊醇、異丙醇、乙醇及PCR試劑均購于哈爾濱寶泰克生物科技有限公司.

1.3 主要儀器

TGL-16G型臺(tái)式離心機(jī)、DK-80型電熱恒溫水槽、WFZ UV-2100型紫外可見分光光度計(jì)、DYY-10型(ECP3000)三恒電泳儀、TAKARA TP600 PCR儀、Bio-RAD Universal HoodⅡ凝膠成像儀和電腦750 W微波爐均為本實(shí)驗(yàn)室儀器.

1.4 引物

參照文獻(xiàn)［21］合成擴(kuò)增牛12SrRNA基因設(shè)計(jì)特異性引物cow-1:5'-CTAGAGGAGCCTGTTCTATAAT-CGATAA-3';cow-2:5'-AAATAGGGTTAGATGCACT-GAATCTAT-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物 344 bp，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成.

1.5 DNA提取方法

熱解法、異丙醇沉淀法、CTAB法、SDS法、高鹽低pH法、異硫氰酸胍法的具體步驟見文獻(xiàn)［1，3］.

1.6 基因組DNA純度和質(zhì)量濃度檢測

［1，3］進(jìn)行檢測.根據(jù)ρ(DNA)/(mg·L-1)=50×D(260nm)×501計(jì)算DNA質(zhì)量濃度;根據(jù)D(260nm)/D(280nm)和D(260nm)/D(230nm)判斷DNA的大致純度.

1.7 瓊脂糖凝膠電泳檢測

5μL 基因組 DNA與1μL6×Loading Buffer混勻，點(diǎn)樣，1.0% 瓊脂糖凝膠電泳(100V，30min)，紫外凝膠成像儀觀察電泳膠板并拍照.

1.8 基因組DNA用于PCR擴(kuò)增的適應(yīng)性檢測

參考文獻(xiàn)［1-4］的反應(yīng)體系和條件.用1.7%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物.

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 奶粉基因組DNA質(zhì)量濃度和純度檢測結(jié)果

奶粉中基因組DNA的提取結(jié)果見表1.可以看出:DNA質(zhì)量濃度最大的為SDS法(495.833mg/L);其次為異丙醇沉淀法和熱解法，分別為302.083和231.250mg/L.高鹽低pH法和CTAB法提取的DNA質(zhì)量濃度最低，分別為31.250和29.167 mg/L.提取得到的DNA的D(260nm)/D(280nm)范圍為1.65～1.87，較為理想;若偏高，表明有RNA污染;若偏低，則表明有蛋白或苯酚污染，接近1.80效果最好［22-23］.表中數(shù)據(jù)也表明CTAB法和異丙醇沉淀法提取的基因組DNA的純度較高，其他4種方法均較低.因此，也不能排除由于雜質(zhì)的影響而使DNA質(zhì)量濃度的測量結(jié)果偏大的可能.

表1 奶粉基因組DNA的質(zhì)量濃度和純度

2.2 奶粉基因組DNA的瓊脂糖電泳檢測結(jié)果

奶粉基因組DNA的質(zhì)量濃度和純度進(jìn)一步采用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，結(jié)果見圖1.CTAB法提取的奶粉基因組DNA譜帶單一，無碎片和連片;重復(fù)試驗(yàn)的DNA條帶遷移率一致，說明此方法具有較好的穩(wěn)定性以及此法提取的基因組DNA完整性好.其他5種方法提取的基因組DNA在凝膠上沒有出現(xiàn)譜帶，其可能原因:一是DNA質(zhì)量濃度較低;二是沒有提取到DNA.

2.3 PCR擴(kuò)增結(jié)果

奶粉基因組DNA的PCR反應(yīng)結(jié)果見圖2.結(jié)果顯示，PCR產(chǎn)物的量不取決于DNA的質(zhì)量濃度，而是取決于DNA的提取方法.異丙醇沉淀法和SDS法提取的DNA質(zhì)量濃度較高，卻不能得到滿意的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物.其他4種方法提取的基因組DNA樣品的PCR擴(kuò)增片段大小與預(yù)期一致，且重復(fù)性好.說明這4種方法提取的基因組DNA可以直接用于牛特異性片段的PCR擴(kuò)增.因此，認(rèn)為這4種方法提取的奶粉基因組DNA均適用于PCR檢測.其中熱解法和CTAB法特異性條帶更清晰，效果更好.

圖1 奶粉基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳

圖2 牛特異性引物擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳

3 討論

PCR技術(shù)以及建立在PCR基礎(chǔ)上的分子標(biāo)記技術(shù)，能以微觀的視角解釋其他技術(shù)現(xiàn)在無法解決的問題.但是，由于PCR擴(kuò)增對模板DNA的質(zhì)量要求較高，DNA質(zhì)量是影響分子實(shí)驗(yàn)結(jié)果的關(guān)鍵因素之一［1-4，18-19］.

在提取奶粉基因組DNA的過程中要注意:奶粉開封后陰涼干燥處保存，避免雜菌污染和吸濕結(jié)塊;奶粉在進(jìn)行去蛋白步驟時(shí)，顛倒混勻要充分(保持一段時(shí)間)，以增加抽提效果;水浴加熱時(shí)要使管蓋高出水面并保持一定的高度，避免Eppordorf管炸開，污染樣品.

4 結(jié)論

1)奶粉中的DNA含量很少，這6種方法獲得的提取物中均有蛋白質(zhì)污染.

2)熱解法、CTAB法、高鹽低pH法和異硫氰酸胍法提取的奶粉基因組DNA均適用于PCR檢測.綜合考慮基因組DNA的純度和質(zhì)量濃度，認(rèn)為這4種方法的優(yōu)劣依次為:熱解法、異硫氰酸胍法、高鹽低pH法和CTAB法.

3)這4種奶粉基因組DNA提取方法均具有操作簡便、省時(shí)、利于快速檢測等優(yōu)點(diǎn).可以根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)條件和要求選擇相應(yīng)的DNA提取方法.

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