病理性疼痛和脾切除手術(shù)對(duì)老年雄性大鼠海馬細(xì)胞膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶和細(xì)胞凋亡的不同影響

朱雅斌，孫燦林，謝國(guó)柱，錢濤，姜琳

(泰州市人民醫(yī)院麻醉科，江蘇泰州225300)

病理性疼痛和脾切除手術(shù)對(duì)老年雄性大鼠海馬細(xì)胞膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶和細(xì)胞凋亡的不同影響

朱雅斌，孫燦林，謝國(guó)柱，錢濤，姜琳

(泰州市人民醫(yī)院麻醉科，江蘇泰州225300)

目的探討病理性疼痛和脾切除術(shù)對(duì)老年雄性大鼠海馬細(xì)胞膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶和細(xì)胞凋亡的不同影響及其機(jī)理。方法選擇60只老年雄性大鼠，隨機(jī)分為3組，A組單純麻醉，只給予麻醉處理(單純麻醉組)；B組在左側(cè)大腿中部切開，暴露坐骨神經(jīng)后用4-0絲線結(jié)扎4道，常規(guī)縫合皮膚(CCI組)；C組給予脾切除手術(shù)之后常規(guī)縫合傷口(脾切除組)。三組再按術(shù)前1 d、術(shù)后1 d、7 d、14 d 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)，將每組再分為4個(gè)小組(n=5)。分別為：A1、A2、A3、A4，B1、B2、B3、B4，C1、C2、C3、C4，在術(shù)前1 d和術(shù)后1 d、7 d、14 d按時(shí)間點(diǎn)經(jīng)10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，開胸經(jīng)升主動(dòng)脈依次灌注生理鹽水100 ml和4%多聚甲醛-PBS復(fù)合液300 ml后，開顱取腦，石蠟切片后分別進(jìn)行HE和CHAT免疫組化染色，光鏡下觀察海馬組織細(xì)胞形態(tài)變化。結(jié)果HE染色顯示CCI組錐體層細(xì)胞損傷重，有較多凋亡形態(tài)細(xì)胞出現(xiàn)，高峰在術(shù)后14 d，脾切除組錐體層和顆粒層均有損傷，出現(xiàn)細(xì)胞減少，形態(tài)改變；CHAT免疫組化染色3組均有CHAT陽性細(xì)胞數(shù)的減少，術(shù)后7 d、14 d CCI組較脾切除組染色明顯偏淺。結(jié)論病理性疼痛和脾切除組造成海馬細(xì)胞損傷的位置和程度不同，可能存在不同的機(jī)制。

疼痛；脾切除；膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶；細(xì)胞凋亡

手術(shù)刺激是造成術(shù)后患者認(rèn)知功能障礙的重要因素，大腦海馬細(xì)胞在認(rèn)知中扮演著重要角色，認(rèn)知功能障礙與海馬突觸可塑性改變密切相關(guān)，包括突觸結(jié)構(gòu)和功能的可塑性[1]，因此海馬的損傷是衡量認(rèn)知功能障礙的重要指標(biāo)。但是，由于手術(shù)種類繁多，各類手術(shù)刺激造成的海馬細(xì)胞凋亡機(jī)制是否均相同目前尚不清楚。本課題選取坐骨神經(jīng)慢性壓迫(CCI)疼痛模型和脾切除模型造成雄性老齡大鼠認(rèn)知障礙，觀察兩種手術(shù)類型造成海馬細(xì)胞凋亡的表像是否相同并探討可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 一般資料選用18～20個(gè)月齡的SD大鼠經(jīng)篩選剔除體重過大或過輕及在水中不游動(dòng)者，共選出動(dòng)物60只，體重450～500 g。參照隨機(jī)數(shù)字表，60只大鼠隨機(jī)分為3組，樣本量根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)估算得出。A組：?jiǎn)渭兟樽斫M；B組：CCI組；C組：脾切除組。各組再根據(jù)術(shù)前1 d、術(shù)后1 d、7 d、14 d 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)再分為A1、A2、A3、A4、B1、B2、B3、B4、C1、C2、C3、C4共12個(gè)組。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法建立模型前均采用10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉后，局部消毒。A組給予麻醉處理，常規(guī)喂養(yǎng)，僅作對(duì)照；B組采用Bennett等[2]的方法于大鼠左側(cè)大腿中部切開，暴露坐骨神經(jīng)，在其分叉處用4-0絲線間隔1 mm松扎4道，逐層縫合；C組大鼠行脾切除術(shù)，之后以1#絲線關(guān)腹。手術(shù)傷口均常規(guī)覆以青霉素粉末，術(shù)后未有感染發(fā)生。造模之后1 d、7 d、14 d予10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉，先經(jīng)左心室向升主動(dòng)脈注射肝素0.l ml抗凝，再依次灌入生理鹽水(4℃)約100 ml、PBS液-多聚甲醛混合液(pH 7.4，4℃)300 ml；然后開顱取腦，剝離海馬，標(biāo)本在PBS液-多聚甲醛混合液(pH 7.4，4℃)中浸泡48 h。各組動(dòng)物取左側(cè)腦組織石蠟包埋切片。以能切取的海馬最大面為中心，行5 μm連續(xù)冠狀面切片，每只鼠取4張切片。取間隔的兩張做HE染色觀察大體變化；右側(cè)腦組織行30 μm連續(xù)冠狀面切片，取兩張片做膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(CHAT)免疫組化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，方法采取完全隨機(jī)設(shè)計(jì)的方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組大鼠海馬CA3區(qū)錐體細(xì)胞HE染色HE染色顯示，CCI組和脾切除組在術(shù)后1 d、7 d、14 d均有明顯的細(xì)胞數(shù)減少，和A1組比較，B組1 d、7 d、 14 d和C組1 d、7 d、14 d均有明顯細(xì)胞數(shù)減少(P＜0.05)，B組術(shù)后14 d和術(shù)后1 d相比減少明顯(P＜0.05)，見表1。

表1 三組大鼠海馬CA3區(qū)錐體細(xì)胞HE染色40×10倍鏡下計(jì)數(shù)(個(gè)，n=5,)

表1 三組大鼠海馬CA3區(qū)錐體細(xì)胞HE染色40×10倍鏡下計(jì)數(shù)(個(gè)，n=5,)

注：和A1組比較，#P＜0.05；和A1組比較，*P＜0.05；和A1組比較，△P＜0.05；和A3、A4組比較，◆P＜0.05；和B2組比較，*◆P＜0.05。

組別細(xì)胞數(shù)組別細(xì)胞數(shù)組別細(xì)胞數(shù)A1組A2組A3組A4組58.60±2.51 50.60±3.58#51.80±6.06 48.60±4.15 B1組B2組B3組B4組59.80±3.27 50.80±5.07*45.60±5.13*34.80±6.65*◆C1組C2組C3組C4組60.40±3.21 45.60±6.80△49.80±4.92△48.00±5.83

2.2 三組大鼠海馬細(xì)胞CHAT免疫組化染色陽性細(xì)胞數(shù)比較單純麻醉組CHAT含量沒有明顯減少，CCI組術(shù)后1 d、7 d、14 d逐漸減少，術(shù)后1 d、7 d、14 d CHAT陽性細(xì)胞數(shù)均少于A1組(P＜0.05)，脾切除組術(shù)后1 d CHAT陽性細(xì)胞數(shù)最少(P＜0.05)，術(shù)后7 d、14 d逐漸恢復(fù)，見表2。

表2 三組大鼠海馬細(xì)胞CHAT免疫組化染色陽性細(xì)胞數(shù)(個(gè)，n=5,)

表2 三組大鼠海馬細(xì)胞CHAT免疫組化染色陽性細(xì)胞數(shù)(個(gè)，n=5,)

注：和A1組比較，#P＜0.05。

A1組A2組A3組A3組59.20±3.27 44.40±5.86#50.00±7.91 54.40±5.41 57.60±6.58 53.00±8.03 59.80±3.70 57.80±5.54 B1組B2組B3組B4組59.00±2.92 50.00±5.61 44.80±8.07#36.80±6.30#C1組C2組C3組C4組

2.3 HE染色結(jié)果染色顯示CCI組和脾切除組術(shù)后14 d海馬細(xì)胞出現(xiàn)較明顯的細(xì)胞數(shù)量減少，且多數(shù)細(xì)胞核深染明顯減少，見圖1。

圖1 術(shù)后14 d HE染色結(jié)果

2.4 術(shù)后14 d膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(CHAT)免疫組化染色結(jié)果CHAT免疫組化染色顯示CCI組和脾切除組術(shù)后14 d CHAT陽性細(xì)胞數(shù)量明顯減少，且B組減少更明顯，說明海馬區(qū)膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶數(shù)量明顯減少，見圖2。

圖2 術(shù)后14 d膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(CHAT)免疫組化染色結(jié)果

3 討論

CCI組術(shù)后1 d、7 d、14 d的細(xì)胞數(shù)明顯少于術(shù)前1 d(P＜0.05)，并且14 d損傷最重，細(xì)胞丟失最多。脾切除組術(shù)后1 d組可觀察到細(xì)胞減少，和術(shù)前相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，說明脾切除可以造成大鼠大腦海馬細(xì)胞的減少，但是在術(shù)后7 d、14 d細(xì)胞數(shù)相對(duì)穩(wěn)定,大腦海馬細(xì)胞損傷較CCI組輕。

HE染色顯示，CCI組和脾切除組對(duì)于海馬細(xì)胞的損傷部位有所區(qū)別，CCI組主要損傷CA3區(qū)錐體層細(xì)胞，表現(xiàn)為術(shù)后14 d細(xì)胞數(shù)量減少，層次不清，可見較多凋亡形態(tài)細(xì)胞，可達(dá)60～70個(gè)/40×10倍鏡，細(xì)胞體積普遍縮小、大小不一、形態(tài)不規(guī)則，胞漿紅染，胞核皺縮，輪廓模糊不清，顆粒層細(xì)胞基本保持完好。脾切除組對(duì)于錐體層和顆粒層細(xì)胞均有損傷，并且顆粒層細(xì)胞損傷更重，均出現(xiàn)了細(xì)胞數(shù)量減少，凋亡細(xì)胞出現(xiàn)，表現(xiàn)為細(xì)胞體積縮小，細(xì)胞皺縮，輪廓模糊，錐體層凋亡樣細(xì)胞有24～38個(gè)/40×10倍鏡下，顆粒層達(dá)到138個(gè)/40×10倍鏡。足夠的錐體層神經(jīng)元去極化后激活谷氨酸受體NMDA亞型，通道打開，Ca2+離子內(nèi)流，細(xì)胞內(nèi)Ca2+增加觸發(fā)一系列反應(yīng)，引發(fā)LTP (長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng))促進(jìn)學(xué)習(xí)和記憶[1]。CCI組的認(rèn)知障礙主要是疼痛引起的應(yīng)激造成海馬CA3區(qū)錐體神經(jīng)元細(xì)胞萎縮。應(yīng)激反應(yīng)促進(jìn)酸性氨基酸釋放，通過間接興奮齒狀回顆粒細(xì)胞而損傷CA3區(qū)神經(jīng)元。其次，CA3區(qū)錐體細(xì)胞缺乏鈣結(jié)合蛋白D28k和小清蛋白，而齒狀回神經(jīng)元主要是顆粒細(xì)胞層則具有鈣結(jié)合蛋白，鈣超載是造成神經(jīng)細(xì)胞損傷的重要原因，鈣結(jié)合蛋白對(duì)神經(jīng)細(xì)胞有一定的保護(hù)作用，所以顆粒細(xì)胞相對(duì)于錐體細(xì)胞不容易被損傷，這使得CA3區(qū)錐體細(xì)胞在應(yīng)激時(shí)更容易被損傷。糖皮質(zhì)激素在慢性應(yīng)激中的作用可能是加強(qiáng)酸性氨基酸對(duì)CA3錐體細(xì)胞的損傷效應(yīng)[3]。脾切除組對(duì)海馬細(xì)胞錐體層和顆粒層均有損傷有可能是由于脾切除對(duì)大鼠神經(jīng)系統(tǒng)的短期影響更大造成的。

CHAT免疫組化分析表明，CCI模型組從術(shù)后1 d開始陽性細(xì)胞數(shù)開始下降，一直持續(xù)到術(shù)后14 d，脾切除組術(shù)后1 d下降最明顯，之后緩慢恢復(fù)。乙酰轉(zhuǎn)移酶CHAT是腦內(nèi)膽堿能系統(tǒng)中的重要的酶類，反映了中樞神經(jīng)系統(tǒng)乙酰膽堿的活性，乙酰膽堿系統(tǒng)與學(xué)習(xí)記憶能力關(guān)系密切。本次實(shí)驗(yàn)證明病理性疼痛比麻醉和脾切除手術(shù)對(duì)海馬細(xì)胞的影響強(qiáng)烈并且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，這可能和神經(jīng)病理痛的高峰發(fā)生在造模后12～14 d有關(guān)[4-5]。

由此可見，CCI組和脾切除組造成術(shù)后認(rèn)知功能障礙的機(jī)制可能有所不同，除了兩者都影響海馬細(xì)胞CHAT的含量外，病理性疼痛引起大腦海馬錐體細(xì)胞的凋亡和缺失造成認(rèn)知障礙，而脾切除手術(shù)則同時(shí)影響錐體層和顆粒層細(xì)胞，造成認(rèn)知障礙。

[1]陳誼,蔡文瑋,盛凈.糖尿病模型大鼠認(rèn)知功能障礙及海馬N-甲基-D-天冬氨酸受體表達(dá)變化[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志,2010,26 (17)：3098-3101.

[2]Bennett GJ,Xie YK.A peripheral mononeuropathy in rat that produces disorders of pain sensation like those seen in man[J]. Pain,1988,33(1)：87-107.

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Effect of pathological pain and splenectomy on choline acetyltransferase and apoptosis in hippocampus cells of aged male rats.

ZHU Ya-bin,SUN Can-lin,XIE Guo-zhu,QIAN Tao,JIANG Lin.Department of Anesthesiology,Taizhou Municipal People's Hospital,Taizhou 225300,Jiangsu,CHINA

ObjectiveTo investigate the different effects of pathological pain and splenectomy on the choline acetyltransferase and the apoptosis in hippocampus cells of aged male rats,and to investigate the mechanisms.Methods Sixty aged male rats were divided into three groups：group A,group B and group C.The rats in group A were treated with anesthesia simply,and those in group B were cut in the middle of the left thigh,and ligated 4 times with 4-0 silk thread after the exposure of sciatic nerve,with the skin sutured routinely then.Rats in group C were given spleen surgery and routine suture of the skin.The three groups were each divided into 4 sub-groups according to different time points(one day before operation,1 day,7 days,14 days after operation),namelyA1,A2,A3,A4,B1,B2,B3,B4,C1,C2,C3,C4,with 5 rats in each sub-group.The rats in each group was anesthetized by 10%chloral hydrate at 4 time points,and then infused by 100 ml saline and 300 ml 4%POM-PBS composite though the ascending aorta.Craniotomied for brain,paraffin sections were carried out after HE and CHAT immunohistochemical staining.The changes of the hippocampus morphology were observed under a light microscope.ResultsIn HE staining revealed that pyramidal layer injured badly in group B,which reached the peak 14 days after the operation,with a lot of apoptotic cells.In group C,pyramidal layer and granular layer were both injured badly,with the number of cells reduced and the cell morphology changed.The number of positive cells reduced in the three groups in CHAT immunohistochemical staining.The dye color of group B was lighter than that in group C 7 days and 14 days after operation.ConclusionThe location and extent of the injury of the hippocampal cells caused by pathological pain and splenectomy were different,with different mechanisms.

Pain;Splenectomy;Choline;Acetyltransferase;Apoptosis

R-332

A

1003—6350（2012）24—017—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2012.24.007

2012-05-08)

朱雅斌(1980—)，男，內(nèi)蒙古呼和浩特市人，住院醫(yī)師，碩士。