許俊龍，李玉紅，張 杰，賈愛華，張學東，任玉波

(聊城市人民醫(yī)院，山東 聊城 252000)

胃癌是最常見的胃腸道惡性腫瘤，易發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移。大量的研究表明，胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移是一個多基因多因素參與的多步驟的復(fù)雜的過程，會出現(xiàn)某些腫瘤蛋白基因會出現(xiàn)異常表達。基質(zhì)金屬蛋白溶解酶-9(MMP-9)是基質(zhì)金屬蛋白酶家族中的重要成員，可特異性地降解細胞外基質(zhì)，其表達的增強與腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系［1］。癌組織早期主要通過淋巴道轉(zhuǎn)移，微淋巴管密度(MLVD)是反映腫瘤淋巴管生成的程度，進展期胃癌的研究成果很多，而早期胃癌較少，但可能更能反映胃癌的發(fā)生發(fā)展趨勢。淋巴管特異性抗體D2-40被廣泛運用于淋巴管生成的研究。2000年1月～2010年6月，我們采用免疫組化法檢測了早期胃癌組織中的MMP-9蛋白表達及MLVD，探討早期胃癌的可能發(fā)病機制。

1 資料與方法

1.1 材料 收集聊城市人民醫(yī)院早期胃癌74例存檔病理蠟塊，所有患者均行胃癌根治術(shù)，術(shù)前未接受化療和放射治療。其中男58例，女16例;年齡33～83歲，平均61.58歲。乳頭狀及管狀腺癌36例，低分化腺癌38例;局限于黏膜內(nèi)者26例，侵及黏膜肌層者13例，累及黏膜下層者35例;其中6例可見胃漿膜外淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。所有的病例均胃黏膜取材，取癌周圍基本正常的胃黏膜作為對照組。全部標本經(jīng)10%中性緩沖福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，4μm連續(xù)切片，切片常規(guī)脫蠟，高溫高壓熱抗原修復(fù)，嚴格按照免疫組化ElivisionTMplus試劑盒(福建邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)操作步驟進行免疫組化染色。

1.2 MMP-9蛋白表達及MLVD檢測 即用型鼠抗人MMP-9單克隆抗體和即用型D2-40單克隆抗體均購自福州邁新試劑公司。采用免疫組化ElivisionTMplus法。實驗步驟按說明書進行。用已知陽性片作陽性對照，用PBS液代替一抗作陰性對照。結(jié)果判斷:采用雙盲法，由兩位病理醫(yī)師獨立觀察每張切片5個具有代表性的高倍視野，在組織切片中顯示胞質(zhì)染色為淡黃色至棕核色為陽性細胞標志，根據(jù)腫瘤細胞質(zhì)或核的染色程度及染色細胞百分率進行分析評分:基本不著色為0分，著色淡黃者為1分，棕黃色者者為2分，棕褐色者為3分;著色細胞占計數(shù)細胞百分率≤5%為0分，6% ～25%為1分，26% ～50%為2分，51% ～75%為3分，≥75%為4分，兩者相乘得分0～1分為陰性(－)，2～3分為弱陽性(+)，4～6分為中等陽性(++)，6分以上為強陽性(+++)。(+)～(+++)為陽性。D2-40陽性表達定位于淋巴管內(nèi)皮細胞膜和胞質(zhì)，呈棕黃色。MLVD結(jié)果的判定參考 Weidner的方法［2］，根據(jù)D2-40染色以陽性著色的單個內(nèi)皮細胞或內(nèi)皮細胞簇分別計為1個陽性微淋巴管(MLVD)。先在40倍光學顯微鏡光鏡下確定5個著色密集的區(qū)域，200倍光學顯微鏡光鏡下分別計數(shù)5個視野，取其均值。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。率的關(guān)系采用χ2檢驗，MMP9、D2-40表達的相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)分析法，P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 MMP-9表達及LMVD 見表1。

表1 不同組織中的MM-9的表達及其LMVD比較

2.2 MMP-9表達及LMVD與早期胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系 見表2。MMP-9蛋白陽性者LMVD值為(24.3 ±2.1)條/mm2，陰性者為(12.4 ±3.6)條/mm2(T=7.3657，P ＜0.01)。MMP-9 的表達程度與MLVD呈正相關(guān)(P＜0.01)。MMP-9蛋白陽性者LMVD 為(24.3 ±2.1)條/mm2，而 MMP-9 陰性者LMVD 值為(12.4±3.6)條/mm2，兩者比較有統(tǒng)計學意義(T=7.3657，P ＜0.01)。

表2 MMP-9表達及LMVD與早期胃癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

3 討論

研究表明，惡性腫瘤細胞的擴散轉(zhuǎn)移是其生物學本性之一，而腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移有著非常復(fù)雜的病理生理學因素，多種因素參與其中，正常組織細胞、腫瘤細胞和基質(zhì)之間的粘附連接和脈管因素對其有重要影響，通常認為腫瘤的浸潤轉(zhuǎn)移先是由腫瘤細胞與基底膜粘附進而降解基底膜及細胞外基質(zhì)，使腫瘤細胞突破自身基底膜，在間質(zhì)中形成浸潤灶，再以同樣的方式穿破進入血液或淋巴，隨血液或淋巴到達其他組織器官并再突破脈管基底膜，在局部增殖形成轉(zhuǎn)移灶，因此腫瘤自身基底膜的完整性和腫瘤間質(zhì)血管的形成及其密度在腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用［3］，在參與惡性腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過程的主要酶類中，MMMPs是近年發(fā)現(xiàn)的較重要的一類，其中的MMP-9于近期頗受關(guān)注。MMP-9又稱為Ⅳ型膠原酶或明膠酶B，屬于明膠酶類，其作用底物為明膠蛋白、Ⅳ和Ⅴ型膠原、蛋白聚糖、彈性蛋白以及粘連蛋白等構(gòu)成ECM的重要成份，因此，MMP-9以其能降解基底膜的構(gòu)成蛋白而被認為與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)［4］。本研究發(fā)現(xiàn)早期胃癌的MMP-9陽性表達率明顯正常胃黏膜，提示早期胃癌中MMP-9蛋白高表達有實際意義，目前還沒有合適的生物學指標可以準確的預(yù)測早期胃癌的發(fā)展和預(yù)后。MMP-9在早期胃癌的浸潤、轉(zhuǎn)移中起重要作用，有可能成為判斷早期胃癌生物學行為的重要指標。

影響早期胃癌癌預(yù)后的因素很多，其中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是一個重要的因素。在大多數(shù)實體腫瘤中，癌細胞通過淋巴管向局部淋巴結(jié)擴散是轉(zhuǎn)移性疾病中一個重要的早期事件。腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移需要新脈管生成，腫瘤微脈管形成在許多臨床腫瘤中已被證實是一個判斷轉(zhuǎn)移、預(yù)測預(yù)后的新指標。目前用于反映LMVD的標記物有多種，其中D2-40特異性最強［5］。目前以D2-40為標記來研究早期胃癌的LMVD的報道尚不多見。本研究以D2-40標記正常胃組織及早期胃癌組織中的LMVD，結(jié)果發(fā)現(xiàn)早期胃癌中心區(qū)和周邊區(qū)均見明顯增多的淋巴管，而且管腔擴張的有功能的的淋巴管和管腔閉鎖的無功能的淋巴管未見有明顯區(qū)別，與孫薇等［6］的研究結(jié)果不一致。本研究發(fā)現(xiàn)，早期胃癌組織中LMVD明顯高于正常胃組織，有胃漿膜外淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者LMVD明顯高于無轉(zhuǎn)移者，提示淋巴管生成與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。通過淋巴管轉(zhuǎn)移至引流區(qū)淋巴結(jié)可能是一些腫瘤初始轉(zhuǎn)移階段最主要的途徑，癌細胞以“離散”方式存在于淋巴管內(nèi)，能動性增加，侵襲性增強，易于突破基底膜，向周圍組織浸潤，并穿過淋巴管，發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。提示高LMVD可能是早期胃癌淋巴轉(zhuǎn)移的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，通過D2-40檢測的LMVD可以作為預(yù)測早期胃癌患者淋巴轉(zhuǎn)移風險的指標。

總之，MMP-9和LMVD在早期胃癌中高表達，而且腫瘤組織分化越低，MMP-9表達越強，LMVD越多，淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移性就越大，說明MMP-9有可能是促進腫瘤中微淋巴管生成的重要因素，因而檢測早期胃癌中MMP-9和LMVD能為判斷早期胃癌的預(yù)后提供新的途徑。

［1］Turner HE，Nagy Z，Esiri MM，et al.Role of matrix-metalloprotei Nase-9 in pituitary tumor behavior［J］.J Clin EndocrinolMetab，2000，85(8):2931-2935.

［2］Weidner N.Intratumor microvessel density as a prognostic factor in cancer［J］.Am J Pathol，1995，147(1):9-19.

［3］Egeblad M，Werb Z.New functions for the matrix metallo proteinases in cancer progression［J］.Nat Rev Cancer，2002，2(3):161

［4］Nielsen BS，Sehested M，Kjeldsen L，et al.Expression of matrix metalloproteinase-9 in vascular pericytes in human breast cancer［J］.Lab Invest，1997，77(4):345-355.

［5］van der Auwera I，van den Eynden GG，Colpaert CG，et al.Tumor lymphangiogenesis inflammatory breast carcinoma:a histo-morpho metric study［J］.Clin Cancer Res，2005，11(21):7637.

［6］孫薇，周曉軍，馬恒輝，等.胃腺癌組織中微淋巴管密度的檢測及其臨床病理意義［J］.腫瘤防治研究雜志，2008，35(7):514-523.