天然水溶性甲殼素溶液的性質(zhì)

劉廷國(guó)，李斌

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖北武漢 430070；2.池州學(xué)院材料與化學(xué)工程系，安徽池州 247100）

殼聚糖（chitosan）是甲殼素（chitin）的部分N－脫乙酰產(chǎn)物。甲殼素在自然界中的生物合成量?jī)H次于纖維素，估計(jì)每年自然界生物合成量將近1011t[1]。是迄今發(fā)現(xiàn)的唯一帶正電荷的天然堿性多糖，具有多種特殊生物活性，安全無(wú)毒，對(duì)環(huán)境無(wú)公害。廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、工業(yè)、畜牧業(yè)、環(huán)境保護(hù)、日用化工、化學(xué)分析以及食品、醫(yī)藥衛(wèi)生、生物工程等領(lǐng)域[2－3]。

由于分子內(nèi)、分子間存在強(qiáng)氫鍵相互作用，甲殼素和殼聚糖均不溶于普通溶劑，限制了其廣泛應(yīng)用[4－5]。通過(guò)均相脫乙?；蚓嘁阴；刂泼撘阴６仍?0%左右制備的半脫乙酰甲殼素能溶于水中[6－7]，但對(duì)其性質(zhì)研究不夠深入，目前僅限于實(shí)驗(yàn)室少量制備，尚不能大規(guī)模用于生產(chǎn)。利用凍融循環(huán)處理制備高濃度甲殼素均相溶液，通過(guò)溫和條件下的均相脫乙酰反應(yīng)，制備天然水溶性甲殼素，研究其溶液性質(zhì)，為天然水溶性甲殼素的制備積累基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

甲殼素（食品級(jí)，DDA=21.11%，Mη=1.20×106，過(guò)80目篩）：購(gòu)自浙江金殼生物化學(xué)有限公司。除特別說(shuō)明外，實(shí)驗(yàn)用水均為雙蒸水，所用化學(xué)試劑均為分析純。

冰柜（BC/BD－190S，控溫范圍：4℃～－37℃，上下波動(dòng)0.5℃）：青島海爾特種電冰柜有限公司；冷凍離心機(jī)（BC－010_TY2265）：美國(guó) Beckman公司；紫外光譜儀（UV－1700）：日本Shimadzu公司；圓二色譜儀（J810）：日本Jasco公司。

1.2 水溶性甲殼素的制備

參照文獻(xiàn)[8]方法制備天然水溶性甲殼素（Water SolubleChitin，WSC），脫乙酰度（DDA）=（51.68±0.12）%；利用非均相脫乙酰法制備半脫乙酰甲殼素（Half Deacetylated Chitin，HDC），DDA=（49.51±0.16）%。

1.3 WSC的紫外光譜研究

WSC分別溶于0.01 mol/L乙酸（HAc）、HCl和去離子水中，分別配成1.0 mg/mL溶液，室溫平衡12 h，使用1 cm石英比色皿上機(jī)測(cè)定樣品溶液在190 nm～400 nm的紫外吸收光譜，考察溶劑對(duì)紫外光譜的影響。分辨率1 nm，掃描速率very slow，重復(fù)掃描3次。按相同方法配置樣品溶液分別考察放置時(shí)間和樣品脫乙酰度對(duì)紫外光譜的影響。

1.4 圓二色譜（Circular Dichroism，CD）

WSC分別溶于去離子水和0.01 mol/L HAc中，HDC溶于0.01 mol/L HAc中，配成1.0 mg/mL溶液，以溶劑為參比，使用0.1 mm 400 μL石英比色池測(cè)定樣品溶液在190 nm～300 nm的圓二色譜。儀器先通N2（3L/min～5L/min）預(yù)熱5min，測(cè)試中繼續(xù)通N2（10L/min～15 L/min），溫度 18℃，分辨率 0.1 nm，掃描速度200 nm/min，累加 10次。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外光譜

一般多糖分子結(jié)構(gòu)中不存在生色團(tuán)，更沒(méi)有共軛基團(tuán)，很少用紫外光譜研究其結(jié)構(gòu)。甲殼素卻是1種特殊的多糖，每個(gè)糖殘基的C2位置上有1個(gè)乙酰氨基，是生色團(tuán)，具有紫外吸收。殼聚糖的乙?；m然被脫除，但殘存的少量乙?；匀粫?huì)在紫外區(qū)產(chǎn)生吸收。研究者根據(jù)殼聚糖的這種特性，建立了紫外光譜法測(cè)定殼聚糖脫乙酰度的方法。直接用UV法測(cè)定殼聚糖脫乙酰度簡(jiǎn)便、快捷，可以測(cè)定脫乙酰度60%以上的殼聚糖。劉長(zhǎng)霞等人在此基礎(chǔ)上發(fā)展了一階導(dǎo)數(shù)紫外光譜法、多波長(zhǎng)回歸紫外光譜法等測(cè)定殼聚糖脫乙酰度的方法，比直接測(cè)定重現(xiàn)性好、準(zhǔn)確度高、干擾少[9－10]。

圖1給出了WSC在3種溶劑中的紫外光譜，在250 nm～800 nm范圍內(nèi)無(wú)任何吸收。在208 nm～270 nm溶劑對(duì)紫外光譜幾乎無(wú)影響，在190 nm～208 nm對(duì)其影響較大，HAc與H2O的吸收極其相似，僅僅在吸光度大小上有差異，而HCl對(duì)其影響更為明顯，峰值不變、峰型變窄，這可能與溶劑極性不同有關(guān)。在208 nm～212 nm，吸光度值與波長(zhǎng)呈線性關(guān)系，在水溶液中的擬合方程為：A=－0.328 6λ+71.119（R2=0.996 6）。劉長(zhǎng)霞等人報(bào)道，不同濃度的N－乙?；璂－葡萄糖胺溶液在波長(zhǎng)200、201、202、203 nm處的吸光度值對(duì)波長(zhǎng)作圖得到線性關(guān)系良好的1組直線，其斜率與對(duì)應(yīng)溶液的濃度成正比，可以根據(jù)斜率確定殼聚糖的脫乙酰度[9]。也就是說(shuō)，如果樣品脫乙酰度確定，則斜率應(yīng)該與樣品濃度呈線性關(guān)系。

溫度在20℃～30℃時(shí)，殼聚糖水溶液放置不同時(shí)間的吸光度值與波長(zhǎng)的關(guān)系基本不變（見(jiàn)表1）。實(shí)驗(yàn)選擇在室溫條件下放置12 h后測(cè)定。

表1 時(shí)間對(duì)WSC溶液吸光度的影響Table 1 Effect of time on the absorption of WSC solution

水溶性樣品的DDA在50%左右，實(shí)驗(yàn)選定的樣品脫乙酰度為46%～54%，在此范圍內(nèi)乙酰氨基含量差別極小，因此由DDA引起的吸光度值與波長(zhǎng)的擬合方程的斜率變化極小，可以忽略不計(jì)。

按照上述實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行操作，繪制工作曲線，準(zhǔn)確配置1.0 mg/mL的WSC水溶液，并逐步稀釋成不同濃度的待測(cè)溶液，室溫靜置平衡12 h后上機(jī)測(cè)定，在選定波長(zhǎng)處的吸光度值對(duì)波長(zhǎng)作圖得到線性關(guān)系良好的1組直線，見(jiàn)圖2，線性相關(guān)系數(shù)大于0.990 0（n=5）。利用其斜率與對(duì)應(yīng)溶液的濃度成正比繪制工作曲線。工作曲線的回歸方程為K=－0.326 5c－0.005 2，相關(guān)系數(shù)R2=0.995 1（n=10），線性范圍為0.005 mg/mL～1.000 mg/mL，如圖3所示。然而當(dāng)樣品濃度低于0.025 mg/mL時(shí)，選定波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸光度值小于0.1，而濃度高于0.25 mg/mL時(shí)，吸光度值又大于1，所以最佳線性范圍為0.025 mg/mL～0.250 mg/mL。

2.2 圓二色譜分析

當(dāng)單色左旋與右旋的圓偏振光通過(guò)某種手性樣品時(shí)，該樣品對(duì)左、右旋圓偏振光的吸收不同，這種現(xiàn)象叫做圓二色性。其差值△A=△AL－△AR稱為圓二色值，按波長(zhǎng)掃描就得到了圓二色譜（CD譜）。圓二色光譜儀通過(guò)測(cè)量生物大分子的圓二色光譜從而得到生物大分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)，或者確定某些基團(tuán)如羰基等在手性分子中的位置，是簡(jiǎn)便和快捷的獲得生物大分子結(jié)構(gòu)的手段之一，而且在某些情況下是其它光譜所無(wú)法替代的。

甲殼素分子中含有乙?；鶊F(tuán)，其中的羰基是發(fā)色團(tuán)，雖然其本身是對(duì)稱的，但處在不對(duì)稱的環(huán)境中也會(huì)產(chǎn)生Cotton效應(yīng)，通常在近紫外區(qū)會(huì)發(fā)生n→π*躍遷，產(chǎn)生1個(gè)弱吸收帶，屬R帶吸收。

圖4是WSC和HDC在0.01 mol/L乙酸溶液中的圓二色譜圖，兩者均在190 nm～240 nm間形成1負(fù)Cotton效應(yīng)（長(zhǎng)波方向?yàn)樨?fù)峰，短波方向?yàn)檎澹?，兩者峰形、峰位置不變，但WSC的正、負(fù)峰強(qiáng)度均小于HDC的。這個(gè)Cotton效應(yīng)是由于羰基吸收產(chǎn)生的，曾有研究者認(rèn)為吸收峰強(qiáng)度與乙?；坑嘘P(guān)，而與α、β異頭碳構(gòu)型、分子鏈長(zhǎng)度、離子強(qiáng)度和pH無(wú)關(guān)[11]。然而實(shí)驗(yàn)條件下的2個(gè)樣品DDA無(wú)顯著差異，也就是說(shuō)乙?；繜o(wú)顯著差異，導(dǎo)致二者吸收峰強(qiáng)弱不同的主要原因可能是由于二者在溶液中的構(gòu)象不同，WSC在HAC溶液中分子鏈更為伸展一些，而HDC可能存在更多的螺旋結(jié)構(gòu)或氫鍵相互作用[12]。

圖5給出的是WSC分別在水溶液和0.01 mol/L HAc溶液中的圓二色譜，在2種溶劑中都產(chǎn)生了相同的負(fù)Cotton效應(yīng)，與HDC相比波長(zhǎng)沒(méi)有發(fā)生偏移，但是在水溶液中的Cotton效應(yīng)卻弱于酸溶液中的?？赡茉蚴荳SC在水中氫鍵相互作用更少，更多的以伸展的高分子鏈形式存在；而其在酸溶液中則以聚電解質(zhì)形式存在，聚電解質(zhì)在溶液中的自組裝會(huì)形成一定螺旋結(jié)構(gòu)，因而產(chǎn)生Cotton效應(yīng)較強(qiáng)的現(xiàn)象。說(shuō)明凍融循環(huán)和均相脫乙酰打破了分子間強(qiáng)氫鍵相互作用，使WSC的空間結(jié)構(gòu)更為舒展而更易溶于水中，且較少呈現(xiàn)螺旋結(jié)構(gòu)和無(wú)規(guī)卷曲[12]。

3 結(jié)論

利用凍融循環(huán)處理結(jié)合均相脫乙酰制備了天然水溶性甲殼素，研究了樣品在不同溶劑中的紫外吸收光譜和圓二色譜。3種溶劑中，在208 nm～212 nm范圍內(nèi)樣品溶液吸光度值與波長(zhǎng)呈線性關(guān)系，樣品脫乙酰度確定時(shí)，直線斜率與樣品濃度呈線性關(guān)系。圓二色譜顯示，在稀酸溶液中水溶性樣品比脫乙酰度相當(dāng)?shù)姆撬苄詷悠?，分子鏈更加伸展而易溶于水中?/p>

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