一株產(chǎn)α-葡萄糖苷酶菌株的鑒定和選育

吳孔陽，齊宗獻(xiàn)，黃桂華，曹喜秀，李秋蓉，陳桂光，梁智群，*

（1.廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西南寧 530004；2.廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西南寧 530005）

α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase，EC.3.2.l.20），又名α-D-葡萄糖苷水解酶或α-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，是自然界中普遍存在的一類酶，許多植物、動(dòng)物、微生物等均能夠產(chǎn)生。大多數(shù)α-葡萄糖苷酶可以水解麥芽糖并發(fā)生轉(zhuǎn)苷作用。例如，黑曲霉α-葡萄糖苷酶能從麥芽糖等分子的非還原末端切開α-1，4糖苷鍵，釋放出葡萄糖，并能將游離出的葡萄糖殘基轉(zhuǎn)移到另一個(gè)葡萄糖分子或麥芽糖等分子的α-1，6位，形成非發(fā)酵性的低聚異麥芽糖（主要成分包括異麥芽糖、潘糖、異麥芽三糖等）[1-2]。低聚異麥芽糖能使人體內(nèi)的雙歧桿菌得到顯著增殖[3-4]，促進(jìn)食物的消化吸收，調(diào)整腸道內(nèi)的菌群，增加有益菌的比例，維持腸道正常功能等。工業(yè)生產(chǎn)低聚異麥芽糖的關(guān)鍵酶制劑是α-葡萄糖苷酶[5-6]。國內(nèi)生產(chǎn)低聚異麥芽糖用α-葡萄糖苷酶主要依賴于進(jìn)口，研究主要集中在α-葡萄糖苷酶菌株選育、酶學(xué)性質(zhì)及分子克隆表達(dá)等方面工作。本課題組在篩選海洋微生物的研究中，分離出一株具有較強(qiáng)產(chǎn)α-葡萄糖苷酶活性的菌株，對(duì)其進(jìn)行了形態(tài)鑒定和26 S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析，并探討了該菌株的生長特性，此外，本研究以該菌株為出發(fā)菌進(jìn)行UV-LiCl復(fù)合誘變，篩選得到了1株α-葡萄糖苷酶產(chǎn)量顯著提高的正突變株ZG36。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 海泥樣品

從廣西北海海邊獲取海泥。

1.1.2 培養(yǎng)基

平板初篩培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨10，酵母膏2，甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷 50，MgSO4·7H2O 0.5，KH2PO40.5，瓊脂15，pH為自然條件下值。

麥芽汁斜面培養(yǎng)基（g/L）：10Be'麥芽汁，瓊脂20。

復(fù)篩培養(yǎng)基（g/L）：麥芽糖100，蛋白胨10，酵母膏2，MgSO4·7H2O 0.5，KH2PO40.5，瓊脂 15，pH 為自然條件下值。

發(fā)酵培養(yǎng)基：同復(fù)篩培養(yǎng)基。

YPD 培養(yǎng)基（g/L）：麥芽糖 10，胰蛋白胨 5，酵母粉5。

形態(tài)特征和生理生化特征所用培養(yǎng)基參考生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)和酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)等相關(guān)資料[7-10]。

初始狀態(tài)下公共負(fù)荷為100 Ω,線路電阻分別為8 Ω,5 Ω,2 Ω,0.8 Ω。I1,I2,I3,I4分別表示1#～4#變流器輸出的直流電流;P1,P2,P3,P4分別表示1#～4#變流器輸出的有功功率。由圖6可看出,系統(tǒng)運(yùn)行約0.3 s時(shí),電流和有功功率分配誤差逐漸減少達(dá)到均衡,0.8 s時(shí)公共負(fù)荷突然減少至50 Ω,1.6 s時(shí)又突然增加至70 Ω。根據(jù)本文提出的控制策略,系統(tǒng)在擾動(dòng)后能迅速切換到新的工作運(yùn)行點(diǎn),實(shí)現(xiàn)了分布式電源間輸出電流和輸出功率的均勻分配,滿足負(fù)荷可靠供電,系統(tǒng)穩(wěn)定運(yùn)行,驗(yàn)證了本控制方法的有效性。

1.1.3 菌株和主要試劑

釀酒酵母GXJ-1：由廣西大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院食品與發(fā)酵工程研究所選育；DNA Marker：購自北京天根生化科技有限公司；rTaq酶：購自杭州博日科技有限公司；dNTP：購自TaKaRa公司；蛋白胨、酵母膏等：購自上海生工；甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷、麥芽糖、異麥芽糖、潘糖等：均由Sigma公司生產(chǎn)；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.4 儀器與設(shè)備

YP1200型電子天平：上海精科實(shí)業(yè)有限公司；J2-21高速冷凍離心機(jī)：美國beckman公司；Eppendorf 5418小型高速離心機(jī)：Eppendorf公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：國樺電器有限公司；SPX-250型生化培養(yǎng)箱：上海躍進(jìn)醫(yī)療儀器廠；回轉(zhuǎn)式恒溫調(diào)速搖床柜：上海欣蕊自動(dòng)化設(shè)備有限公司；320 pH Meter：Meter Toledo公司；OLYMPUS數(shù)碼顯微鏡：日本OLYMPUS；化學(xué)發(fā)光熒光凝膠成像系統(tǒng)：基因有限公司；Mini-PROTEIN 3 Cell電泳儀：Bio-Rad公司；島津LC-10AT型高效液相色譜儀：日本島津公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株初篩與復(fù)篩

稱取海泥5 g，放入盛有玻璃珠的95 mL無菌水的三角瓶中，輕輕混勻，打散樣品后靜置。用移液槍從三角瓶中吸取0.5 mL懸濁液注入盛有4.5 mL無菌水的試管中，以此類推，制成 10-2、10-3、10-4、10-5、10-6g/mL各種稀釋度的菌液。用移液槍分別從10-4、10-5和10-6稀釋度的試管中吸取0.1 mL涂到初篩培養(yǎng)基上，每個(gè)梯度3個(gè)平行。涂布平板后把平板倒置于培養(yǎng)箱中30℃培養(yǎng)84 h～96 h后，用已滅菌的牙簽將平板上的單個(gè)菌落一一轉(zhuǎn)接到含有初篩培養(yǎng)基的平板上，繼續(xù)培養(yǎng)96 h，初步得到能夠在初篩培養(yǎng)基中生長的菌株。挑取典型菌落進(jìn)行純培養(yǎng)，純化后的菌株接種于麥芽汁斜面上保存。將初篩的菌株接種于含有50 mL復(fù)篩培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，在30℃、160 r/min的搖床中培養(yǎng)40 h。發(fā)酵結(jié)束后，離心去除菌體得到發(fā)酵上清液，并各取0.2 mL上清液，將其直接接入1.8 mL、已經(jīng)培養(yǎng)13 h的釀酒酵母培養(yǎng)液中，繼續(xù)于30℃、160 r/min的搖床中培養(yǎng)，以對(duì)照管中麥芽糖（濃度為10%）耗盡時(shí)為發(fā)酵終止點(diǎn)，此時(shí)，將各管取1 mL，離心得上清液，取上清液0.1 mL，加入0.4 mL去離子水，再加入0.5 mL DNS溶液，沸水浴中2 min后，補(bǔ)水至6 mL，于波長540 nm下測(cè)定吸光值，記錄數(shù)據(jù)，同時(shí)選取吸光值較大的樣品，將其對(duì)應(yīng)的上清液稀釋5倍后用0.45 μm水系微孔濾膜過濾，并進(jìn)行高效液相色譜分析，檢測(cè)低聚異麥芽糖的生成情況。

1.2.2 菌株的形態(tài)學(xué)觀察和生理生化特征

參考生物學(xué)實(shí)驗(yàn)手冊(cè)和酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)，進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、糖發(fā)酵測(cè)試、碳源同化測(cè)試-液體培養(yǎng)法、淀粉化合物形成等試驗(yàn)。

1.2.5 分子生物學(xué)鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

采用SDS裂解法提取基因組DNA以及引物設(shè)計(jì)參考文獻(xiàn)[11]。通過引物P1（5'-GCA TAT CAA TAA GCG GAGGAA AAG-3'）和 P2（5'-GGT CCG TGT TTC AAG ACG G-3）進(jìn)行PCR擴(kuò)增供試菌株YX41 26S rDNA近5'端的D1/D2區(qū)域，引物由上海鼎安生物科技有限公司合成。PCR反應(yīng)條件：94℃1 min；95℃30 s，53℃ 1 min，72℃ 1.5 min，30個(gè)循環(huán)。

PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后送至上海鼎安生物科技有限公司測(cè)序。測(cè)得結(jié)果通過GenBank進(jìn)行序列相似性搜索，然后采用Clustal X進(jìn)行序列聯(lián)配分析，系統(tǒng)發(fā)育分析通過軟件MEGA4.0完成。

1.2.6 酶活測(cè)定及轉(zhuǎn)苷產(chǎn)物分析

1.2.6.1 α-葡萄糖苷酶活力單位定義[12]

在40℃、pH5.0的條件下，每小時(shí)催化麥芽糖生成1 μmol非發(fā)酵性糖（異麥芽糖或潘糖）所對(duì)應(yīng)的酶量定義為1個(gè)酶活力單位（U/mL）。

1.2.6.2 酶活測(cè)定方法及產(chǎn)物分析

取發(fā)酵液1 mL于2 mL EP管中，12 000 r/min條件下離心2 min，棄上清，用2倍體積的無菌水沖洗菌體，重復(fù)離心一次收集菌體。加入2 mL以pH5.0的磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖液配制的10%（w/v）麥芽糖溶液，混均，40℃水浴1 h，取200 μL加入到1.8 mL已培養(yǎng)12 h釀酒酵母菌液中，于30℃，160 r/min，培養(yǎng)12 h，用DNS法測(cè)定其非發(fā)酵性糖。用島津高效液相色譜儀及Kromasil NH2色譜柱測(cè)定轉(zhuǎn)苷產(chǎn)物潘糖的生成量，色譜條件參照GB/T20881-2007，《低聚異麥芽糖》強(qiáng)制性國家標(biāo)準(zhǔn)中的檢測(cè)方法。

1.2.7 YX41的誘變育種

取已培養(yǎng)10 h至對(duì)數(shù)生長期的伯頓畢赤酵母，梯度釋稀至10-4，調(diào)整其濃度為106個(gè)/mL，同時(shí)將紫外燈預(yù)熱20 min，取3 mL菌懸液置于直徑90cm培養(yǎng)皿中，保持壞境無可見光，于紫外燈下（15 W，30 cm）分別照射 0、30、60、100、120、140、160、180、200 s。在紅光的保護(hù)下，將照射后的菌液取0.1 mL涂布于含LiCl的平板，30℃避光培養(yǎng)3 d，觀察、記錄菌落生長狀況。用平板菌落計(jì)數(shù)法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，計(jì)算致死率[13-14]。復(fù)合誘變時(shí)選擇UV光源垂直距離為30 cm，功率15 W，照射60 s，取0.1 mL涂布于LiCl選擇培養(yǎng)基平板上，黑暗中30℃恒溫培養(yǎng)。30℃恒溫培養(yǎng)3 d，再挑選較大菌落進(jìn)行轉(zhuǎn)化能力測(cè)定，進(jìn)一步淘汰轉(zhuǎn)化水平低的菌株。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株篩選

在菌株初篩的過程中，選用甲基-α-D-吡喃葡萄糖苷作為唯一碳源，能夠快速篩選出產(chǎn)生α-葡萄糖苷酶的菌株，由于α-葡萄糖苷酶對(duì)底物的水解和轉(zhuǎn)苷機(jī)制相對(duì)比較復(fù)雜[15]，初篩得到的菌株，有水解能力，不一定具備轉(zhuǎn)苷能力，即發(fā)酵產(chǎn)物可能得不到非發(fā)酵性糖，所以在菌株復(fù)篩的過程中，直接通過釀酒酵母利用殘?zhí)菍?shí)驗(yàn)和高效液相色譜法檢測(cè)非發(fā)酵性糖生成情況，初篩平板上分離得到236菌株，挑取典型菌落接入復(fù)篩培養(yǎng)基中進(jìn)行復(fù)篩，最終得到一株α-葡萄糖苷酶活力穩(wěn)定的野生菌株YX41。

2.2 形態(tài)特征

YX41菌株在YM平板、28℃培養(yǎng)72 h后，平板上的菌落呈乳白色，表面較干燥，且凹凸不平，周圍有放射狀毛刺，并向外擴(kuò)張，如圖1A所示。菌株在YM液體培養(yǎng)基里，肉眼能看到培養(yǎng)基中毛絨狀菌絲體，顯微鏡觀察到細(xì)胞呈橢圓形，卵形，柱形，有些具有菌環(huán)和醭膜，較多假絲中橫交錯(cuò)。在顯微鏡下觀察可看到細(xì)胞呈橢圓形，其顏色呈無色和黑色，有些表面可看到網(wǎng)眼。假菌絲呈藕節(jié)狀，可看到隔膜如圖1B所示。將載玻片上菌體固定并噴金后，在掃描電鏡下觀察其生長形態(tài)，可以很清楚看到菌體的微觀結(jié)構(gòu)，如圖1C所示。

2.3 生理生化特性

糖發(fā)酵測(cè)試結(jié)果和碳源同化測(cè)試結(jié)果分別見表1和表2。

表1 糖發(fā)酵測(cè)試結(jié)果Table 1 The results of sugar fermentation

表2 碳源同化測(cè)試結(jié)果Table 2 The results of carbon assimilation

由表1可知，該菌不發(fā)酵乳糖。由表2可知，該菌能夠同化山梨醇、麥芽糖、可溶性淀粉、L-阿拉伯糖、鼠李糖、D-木糖、葡萄糖、蔗糖、乙醇；不能同化乳糖、L-山梨糖、硝酸鉀和肌醇。類淀粉物質(zhì)測(cè)試結(jié)果表明，培養(yǎng)基由淡黃色透明狀逐漸變成乳白色，外觀與可溶性淀粉溶液非常相似。

2.4 菌株的分子生物學(xué)鑒定

Blastn分析結(jié)果顯示菌株YX41的26 S rDNA序列與畢赤伯頓酵母具有較高的同源性，兩者在以N-J法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹上聚為同一簇群（如圖2）。根據(jù)及相關(guān)資料，結(jié)合形態(tài)學(xué)分析結(jié)果，將菌株YX41鑒定為畢赤伯頓酵母，命名為Pichia burtonii YX41。

2.5 菌株的轉(zhuǎn)苷產(chǎn)物分析

將酶促轉(zhuǎn)化反應(yīng)液滅活后離心，上清用0.45 μm水系微孔濾膜過濾，然后進(jìn)行高效液相色譜分析（見圖3）。從高效液相色譜圖可以發(fā)現(xiàn)，該酶的主要轉(zhuǎn)苷產(chǎn)物是異麥芽糖和潘糖，潘糖含量較大。

2.6 菌株YX41誘變結(jié)果

YX41經(jīng)過UV-LiCl復(fù)合誘變后獲得的1株轉(zhuǎn)化能力明顯優(yōu)于出發(fā)菌株的突變株，將其命名為ZG36，比出發(fā)菌株酶活力提高了32%。將菌株ZG36在斜面培養(yǎng)基上傳代轉(zhuǎn)接數(shù)次，搖瓶實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該菌株的產(chǎn)酶水平比較穩(wěn)定，見表3。

表3 ZG36的遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The results of hereditary stability experiment

3 討論

盡管微生物來源α-葡萄糖苷酶已有很多報(bào)道[16-17]，但是有關(guān)海洋微生物產(chǎn)α-葡萄糖苷酶的研究報(bào)道較少。海洋蘊(yùn)藏著豐富的微生物資源，通過本課題組建立的篩選模型[18]，從海泥中分離一株α-葡萄糖苷酶活力較高的Pichia burtoniiYX41菌株，然后對(duì)該菌株進(jìn)行UV-LiCl復(fù)合誘變，選育一株高產(chǎn)α-葡萄糖苷酶菌株 ZG36。從 Takeuchi、Naumoff及 Prodanovi'c等[19-21]諸多對(duì)酵母產(chǎn)淀粉酶系的研究來看，尚未見畢赤伯頓酵母產(chǎn)α-葡萄糖苷酶的報(bào)道，從搖瓶復(fù)篩結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Pichia burtoniiYX41能夠快速、高效地利用麥芽糖，較短的發(fā)酵周期積累低聚異麥芽糖，這也為制備低聚異麥芽糖提供了新的參考。

雖然本研究在選育方面取得了一定的效果，但是與實(shí)際應(yīng)用還有一定的距離，本課題組長期從事α-葡萄糖苷酶菌株菌株選育工作，已經(jīng)選育多種α-葡萄糖苷酶產(chǎn)生菌，基于此，后繼研究將考慮雙親跨界融合技術(shù)，嘗試與實(shí)驗(yàn)室保藏的另外一株α-葡萄糖苷酶產(chǎn)生菌株進(jìn)行原生質(zhì)體融合，以期獲得產(chǎn)酶能力更強(qiáng)，更穩(wěn)定的高產(chǎn)菌株；同時(shí)將對(duì)該菌株所產(chǎn)α-葡萄糖苷酶進(jìn)行分離純化，為該酶的分子生物學(xué)研究提供相應(yīng)的參考。

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