李杜漸 徐耀庭 韋 芳 李惠民 黃汝強(qiáng) 許曉文 顧 煒 顧偉平

1 上海市第一人民醫(yī)院分院泌尿外科 200081； 2 上海交通大學(xué)附屬上海市第一人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心

卡介苗（Bacillus Calmette－Guerin，BCG）膀胱內(nèi)灌注治療表淺性膀胱移行細(xì)胞癌，是目前最成功的腫瘤免疫治療。但與此同時(shí)其顯著的毒副反應(yīng)使得卡介苗在臨床上的應(yīng)用受到限制。因此利用基因工程技術(shù)改造BCG菌株，以加強(qiáng)其免疫原性和抗瘤作用是，降低其毒副作用是大家研究的熱點(diǎn)。由于單核細(xì)胞趨化因子－1（MCP－1）在膀胱腫瘤免疫治

療中起到重要作用且與BCG治療效果有關(guān)。因此，本實(shí)驗(yàn)利用基因工程技術(shù)在克隆BCG Ag85B和MCP－1基因的基礎(chǔ)上，將構(gòu)建穿梭表達(dá)質(zhì)粒，欲將該質(zhì)粒導(dǎo)入BCG，使BCG表達(dá)分泌MCP－1，達(dá)到構(gòu)建重組BCG的目的。

1 材料和方法

1.1 材料 Taq DNA 聚合酶、Eco RⅠ、SaⅡ、Bam HⅠ、T4DNA連接酶、DNA Marker DL2000、Marker DL15000購(gòu)于上海皓嘉科技發(fā)展有限公司。BCG上海丹麥株由上海市生物制品研究所惠贈(zèng)。質(zhì)粒p M V261（Stover CK博士構(gòu)建）由四川大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院徐恒教授惠贈(zèng) 。人MCP－1c DNA由上海交通大學(xué)附屬上海市第一人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心提供。大腸桿菌DH 5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)于天根生化科技（北京）有限公司。PCR產(chǎn)物純化試劑盒購(gòu)于上海華舜生物工程公司。

1.2 引物合成及聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增 根據(jù)BCG抗原85B（BCG Ag85B）信號(hào)肽序列自行設(shè)計(jì)一 對(duì)引物。F5’端引入Bam HⅠ酶切位點(diǎn)，R：5’端引入Eco RⅠ酶切位點(diǎn)。F：5’GATGGA TCCAA T GACAGACGTGAGCCGAAAG3’；R：5’GTAGA A TTCCGCGCCCGCGGT TGCCGCTCC 3’。MCP－1的引物 設(shè)計(jì)，F(xiàn)：5’CGGA A TTCCACTCTCGCCTCCAGCA TGA AA3’，R：5’ACGCGTCGACGG GTTGTGGAGTGAGTGTTCAA3’。F：5’端引入Eco RⅠ酶切位點(diǎn)，R：5’端引入SaⅡ酶切位點(diǎn)。引物由上海皓嘉科技發(fā)展有限公司合成。PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性3min，94℃變性45s，60℃復(fù)性1min，72℃延伸1min，共循環(huán)30次，最后72℃繼續(xù)延伸7min。PCR產(chǎn)物用PCR產(chǎn)物純化試劑盒參照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行純化。

1.3 質(zhì)粒p M V261的提取和純化 用堿裂解法提取質(zhì)粒進(jìn)行［1］。

1.4 重組質(zhì)粒p MS的構(gòu)建 將合成后的BCG Ag85B信號(hào)肽基因克隆至質(zhì)粒p MV261并測(cè)序鑒定。信號(hào)肽基因及質(zhì)粒p MV261分別用Bam HⅠ和EcoRⅠ酶雙酶切，p MV261酶切后加入小牛腸堿性磷酸酶1U，于37℃去磷酸化1h，經(jīng)酚∶氯仿（1∶1）抽提，無(wú)水乙醇沉淀、70%乙醇洗滌后溶于TE中。然后加入10×連接緩沖液2μL、T4DNA連接酶1μL，以純水補(bǔ)足總體積為2μL，于16℃進(jìn)行連接反應(yīng)16h，構(gòu)建重組質(zhì)粒p MS。大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞的制備及連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5 陽(yáng)性重組質(zhì)粒p MS的篩選與鑒定 重組質(zhì)粒p MS的篩選與鑒定參見(jiàn)文獻(xiàn)［2］。

1.6 MCP－1基因與上述陽(yáng)性重組質(zhì)粒的連接和轉(zhuǎn)化 純化后的MCP－1基因c DNA和上述陽(yáng)性重組質(zhì)粒p MS用Eco RⅠ和SalⅠ雙酶切后，按照4方法連接與轉(zhuǎn)化。

1.7 陽(yáng)性重組質(zhì)粒p MS MCP－1的篩選與鑒定按照4方法篩選由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序與鑒定。采用克隆位點(diǎn)上游的啟動(dòng)子序列作為測(cè)序引物進(jìn)行測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒p MS的鑒定 （1）酶切鑒定：選取經(jīng)電泳初步檢測(cè)比p M V261較大的質(zhì)粒，將其用Bam HⅠ和Eco RⅠ雙酶切，以酶切產(chǎn)物為模板，用信號(hào)肽兩端引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，出現(xiàn)120bp左右的目的基因條帶（見(jiàn)圖1）。初步表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，該重組質(zhì)粒命名為p MS。（2）測(cè)序鑒定：用信號(hào)肽測(cè)序引物測(cè)序 ，由測(cè)序結(jié)果可知信號(hào)肽已經(jīng)克隆到p M V261載體中 ，進(jìn)一步證實(shí)了重組質(zhì)粒p MS構(gòu)建成功。

圖1 重組質(zhì)粒酶切鑒定圖

2.2 重組質(zhì)粒p MS MCP－1的鑒定 （1）酶切鑒定：選取經(jīng)電泳初步檢測(cè)比p MS較大的質(zhì)粒，將其用Eco RⅠ和SalⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳顯示，質(zhì)粒已完全打開(kāi)，出現(xiàn)4 188bp和300bp兩條帶，顯示300bp的帶為插入MCP－1片斷，4 188 kb帶為質(zhì)粒p MS（見(jiàn)圖1）。初步表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，將其命名為p MS MCP－1。（2）測(cè)序鑒定：將p MS MCP－1陽(yáng)性重組質(zhì)粒進(jìn)行序列分析。由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，采用克隆位點(diǎn)上游的啟動(dòng)子序列作為測(cè)序引物進(jìn)行測(cè)序，兩種擴(kuò)增產(chǎn)物的結(jié)果與理論值完全一致。由上述質(zhì)粒構(gòu)建過(guò)程可知，在p M V261的Bam HⅠ和Eco RⅠ酶切位點(diǎn)以及p MS的Eco RⅠ和SalⅠ酶切位點(diǎn)之間，分別插入了一約120bp和300bp的片段，而得到一新重組質(zhì)粒，120bp片段為BCG Ag85B信號(hào)肽，而300bp的片段為MCP－1基因 ，進(jìn)一步證實(shí)了重組質(zhì)粒p MS MCP－1構(gòu)建成功。

3 討論

人們對(duì)BCG治療膀胱腫瘤的局部抗瘤免疫反應(yīng)的研究中發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞趨化蛋白－1（monocyte chemotactic protein－1，MCP－1）在BCG抗膀胱腫瘤過(guò)程中膀胱局部表達(dá)明顯增強(qiáng)。膀胱內(nèi)無(wú)瘤狀態(tài)的維 持 與 MCP－1 的 水 平 表 達(dá) 關(guān) 系 密 切［3～5］。 對(duì)MCP－1前期的研究中發(fā)現(xiàn)MCP－1具有良好的抗膀胱 腫 瘤 作 用［6～8］。 筆 者 在 克 隆 BCG Ag85B 和MCP－1基因的基礎(chǔ)上 ，構(gòu)建了穿梭表達(dá)質(zhì)粒。下一步將通過(guò)電穿孔法把該質(zhì)粒導(dǎo)入BCG中，使BCG分泌表達(dá)MCP－1，從而達(dá)到構(gòu)建重組BCG的目的。該重組BCG可望在免疫原性及抗瘤效應(yīng)方面優(yōu)于BCG。其理由有以下幾點(diǎn)：（1）選用的穿梭表達(dá)質(zhì)粒屬于染色體外質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化BCG后不會(huì)改變其染色體的結(jié)構(gòu)與功能，因此不會(huì)改變BCG的減毒特性。（2）穿梭表達(dá)質(zhì)?？蓪?MCP－1基因轉(zhuǎn)入BCG中，使重組BCG同時(shí)具有BCG和MCP－1的雙重功能。（3）進(jìn)行膀胱灌注時(shí)，重組BCG可直接接觸和刺激腫瘤組織，局部表達(dá)的較高濃度的MCP－1既可直接殺死腫瘤細(xì)胞，也能夠增強(qiáng)重組BCG介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。同時(shí)重組BCG和 MCP－1只黏附在腫瘤周圍，不進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)，故毒副作用減少。綜上所述，通過(guò)構(gòu)建了穿梭表達(dá)質(zhì)粒p MS MCP－1，為下一步構(gòu)建表達(dá)分泌性 MCP－1的重組BCG打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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