白 潔 李衛(wèi)芬 黃 琴 崔志文 余東游 黃 怡，2*

(1.浙江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，浙江大學(xué)動物分子營養(yǎng)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗室，杭州 310058;2.廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧 530005)

黏附是微生物與宿主腸道相互作用的第1步，也是進(jìn)入腸道的微生物發(fā)揮作用的前提［1］。黏附和定植于宿主腸道的能力是益生菌的評價標(biāo)準(zhǔn)之一，益生菌株必須對上皮細(xì)胞組織具有黏附性才能長期在腸道中存活并發(fā)揮其作用［2］。黏附在腸道的益生菌可以通過空間占位，產(chǎn)生抑菌物質(zhì)等對腸道病原菌發(fā)揮抑制作用，調(diào)整腸道菌群平衡。同時，黏附也是感染性細(xì)菌致病的第1步，如果能抑制病原菌對宿主細(xì)胞的黏附，往往能抑制病原菌的致病作用［3］。因此，人們常將益生菌的黏附性能及其對致病菌的黏附抑制作用作為菌株質(zhì)量評定的重要指標(biāo)。目前，國內(nèi)外有關(guān)乳酸菌對細(xì)胞的黏附及其對病原菌的黏附抑制作用的研究報道較多，并且發(fā)現(xiàn)一些有較好黏附性能的益生乳酸菌［4－5］，但是關(guān)于其對腸上皮細(xì)胞的黏附是否具有菌屬和宿主特異性方面的研究報道較少。腸上皮樣細(xì)胞系Caco－2細(xì)胞是從人結(jié)腸腺癌中建立的，是目前研究細(xì)菌或病毒與腸道黏膜黏附應(yīng)用最廣泛的細(xì)胞模型。該細(xì)胞模型能夠在體外進(jìn)行形態(tài)功能分化，表現(xiàn)出成熟腸上皮細(xì)胞的特性。因此，本試驗采用目前國內(nèi)外學(xué)者普遍使用的體外培養(yǎng)Caco－2細(xì)胞的方法來評價幾株不同來源的益生乳酸菌的黏附能力及其對大腸桿菌K88和鼠傷寒沙門氏菌的黏附抑制作用，并探討不同種屬及來源的菌株對Caco－2細(xì)胞的黏附性能的差異，為乳酸菌更好地應(yīng)用于生產(chǎn)及探討其黏附機(jī)制提供初步的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株和細(xì)胞株

L1～L6 6個乳酸菌菌株，L1:鼠李糖乳桿菌(Lactobacillus rhamnosus，編號為 6001)，購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心;L2:食果糖乳桿菌(Lactobacillus fructivorans，編號為6052)凍干粉，購于中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院;L3:乳桿菌(Lactobacillus)，分離于健康雞腸道;L4:糞腸球菌(Enterococcus faecalis，編號為20426)凍干粉，購于中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院;L5:屎腸球菌(Enterococcus faecium)，由浙江大學(xué)飼料科學(xué)研究所微生物與基因工程實(shí)驗室保存;L6:乳酸乳球菌(Lactococcus lactis，編號為23609)，購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。2個致病菌菌株，K88:大腸桿菌(Escherichia coli)K88，購自國家獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心;S:鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)，購自國家獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心。Caco－2細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

1.2 主要試劑和設(shè)備

MRS、GM17和 LB培養(yǎng)基(英國 Oxoid公司);DMEM培養(yǎng)液、0.25%胰酶［含0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)］、D－h(huán)ank’s平衡鹽溶液(美國Gibco公司);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司);青霉素和鏈霉素(美國Sigma公司);Triton X－100和臺盼藍(lán)染色液(美國Ameresco公司)。細(xì)胞培養(yǎng)瓶及培養(yǎng)板(美國Gibco公司);5804R高速冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf公司);HERA cell 150 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司);CX41－12C02倒置顯微鏡(日本Olympus公司);NOVEL XSZ－N107CCD光學(xué)顯微鏡(寧波永新光學(xué)股份有限公司);UV－2100紫外可見分光光度計(尤尼柯上海儀器有限公司);Synergy 4酶標(biāo)儀(美國BioTek公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 供試菌液制備

除了乳酸乳球菌用GM17培養(yǎng)基外，其他乳酸菌都用MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)。乳酸菌、大腸桿菌K88和鼠傷寒沙門氏菌－80℃保存，試驗前乳酸菌接種于新鮮配制的GM17或MRS液體培養(yǎng)基，30℃靜止培養(yǎng)24～36 h，并轉(zhuǎn)接2代。大腸桿菌K88和鼠傷寒沙門氏菌接種于LB培養(yǎng)基，37℃搖床培養(yǎng)過夜，并轉(zhuǎn)接2代。分別將生長至對數(shù)生長期的乳酸菌(16 h)、大腸桿菌K88(8 h)和鼠傷寒沙門氏菌(10 h)在4 000 r/min、15℃離心10 min，收集菌體，用無菌磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，最后重懸于無菌PBS中，調(diào)節(jié)細(xì)菌的濃度為2×108CFU/mL。

1.3.2 細(xì)菌熒光標(biāo)記

按照文獻(xiàn)［6］和［7］的方法標(biāo)記細(xì)菌。把上述準(zhǔn)備好的乳酸菌、大腸桿菌K88和鼠傷寒沙門氏菌(1×109CFU/mL)懸浮于100 mg/mL異硫氰酸熒光素(FITC)中，37℃暗處作用1 h，用PBS洗滌4次去除未結(jié)合的FITC，然后把細(xì)菌懸浮于PBS中，并調(diào)整細(xì)菌的終濃度為1×108CFU/mL，每組設(shè)6個重復(fù)，每個培養(yǎng)孔為1個重復(fù)。

1.3.3 Caco－2 細(xì)胞的培養(yǎng)

Caco－2細(xì)胞用培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，在瓶中加入含10%熱滅活的胎牛血清和雙抗(100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素)的DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d換1次培養(yǎng)液。待細(xì)胞貼壁生長為單層細(xì)胞后(5～7 d)，用0.25%胰酶消化傳代，并用0.4%的臺盼藍(lán)染色液染色，用血細(xì)胞計數(shù)器在顯微鏡下檢測細(xì)胞的數(shù)量和活性，保證細(xì)胞活性在95%以上。

1.3.4 黏附試驗

以不加菌的細(xì)胞為空白對照，試驗組加入1 mL培養(yǎng)液及1 mL熒光標(biāo)記的乳酸菌、大腸桿菌K88和鼠傷寒沙門氏菌(1×108CFU/mL)，將培養(yǎng)板置于37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中分別孵育1 h后，用無菌PBS洗滌3次，將未黏附的菌洗脫。之后每個培養(yǎng)孔中加入0.1 mL胰酶作用5 min，待細(xì)胞完全脫落，加入0.4 mL完全培養(yǎng)液終止反應(yīng)。收集液體，用酶標(biāo)儀測定其熒光強(qiáng)度，吸收光波長為485 nm，發(fā)射光波長為530 nm，測定相對熒光強(qiáng)度，每個組設(shè)6個重復(fù)，每個培養(yǎng)孔為1個重復(fù)。

計算公式:

式中:A為乳酸菌、大腸桿菌K88或鼠傷寒沙門氏菌黏附Caco－2細(xì)胞并洗脫后細(xì)胞懸液的相對熒光強(qiáng)度;A0為乳酸菌、大腸桿菌K88或鼠傷寒沙門氏菌黏附Caco－2細(xì)胞前細(xì)胞懸液的相對熒光強(qiáng)度。

1.3.5 黏附抑制試驗

在96孔板中，每孔加入以上調(diào)整好濃度的細(xì)胞懸液100 μL。試驗設(shè)3個處理，通過熒光標(biāo)記法，采用競爭、排斥和置換試驗來研究乳酸菌對病原菌的黏附抑制作用。

1.3.5.1 競爭試驗

Caco－2細(xì)胞 +乳酸菌(未標(biāo)記)+致病菌(FITC標(biāo)記)→5%CO2、37℃共孵育1 h→離心去上清→PBS洗滌3次→PBS重懸→轉(zhuǎn)移至黑色的96孔板，避光靜置。

1.3.5.2 排斥試驗

Caco－2細(xì)胞 +乳酸菌(未標(biāo)記)→5%CO2、37℃共孵育1 h→離心去上清→加入致病菌(FITC標(biāo)記)→5%CO2、37℃共孵育1 h→其余操作同1.3.5.1。

1.3.5.3 置換試驗

Caco－2細(xì)胞 +致病菌(FITC標(biāo)記)→5%CO2、37℃共孵育1 h→離心去上清→加入乳酸菌(未標(biāo)記)→5%CO2、37℃共孵育1 h→其余操作同1.3.5.1。

以上處理結(jié)束后，各處理的每個培養(yǎng)孔中加入0.1 mL胰酶作用5 min，待細(xì)胞完全脫落，加入0.4 mL完全培養(yǎng)液終止反應(yīng)。收集液體，用酶標(biāo)儀測定其熒光強(qiáng)度，每組設(shè)6個重復(fù)，每個培養(yǎng)孔為1個重復(fù)。

計算公式:

式中:A1為無乳酸菌存在的情況下，黏附在Caco－2細(xì)胞上的大腸桿菌K88或鼠傷寒沙門氏菌的相對熒光強(qiáng)度;A2為乳酸菌存在的情況下，黏附在Caco－2細(xì)胞上的大腸桿菌K88或鼠傷寒沙門氏菌的相對熒光強(qiáng)度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 16.0軟件作統(tǒng)計學(xué)分析，用t檢驗法進(jìn)行差異顯著性分析，以P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌對Caco-2細(xì)胞的黏附作用

由圖1可見，參試的8株菌株的黏附率乳桿菌(L2、L3、L1) ＞ 腸球菌(L5、L4) ＞ 致病菌(K88、S)＞乳球菌(L6)，其中乳酸菌 L1、L2、L3和 L5的黏附率超過50%?？梢?，研究的這幾株益生乳酸菌的黏附性能較好，同時說明乳酸菌對腸上皮細(xì)胞的黏附有菌屬特異性。分離于健康雞腸道的乳桿菌L3和來源于人腸道的乳桿菌L1、L2一樣有較高的黏附率，這說明乳酸菌對腸上皮細(xì)胞的黏附可能無宿主特異性。

圖1 益生乳酸菌對Caco-2細(xì)胞的黏附率Fig.1 The adhesion rate of lactic acid bacteria strains to Caco－2 cells

2.2 益生乳酸菌對大腸桿菌K88黏附Caco-2細(xì)胞的影響

由表1可知，乳酸菌L1、L2、L3和 L4對大腸桿菌K88黏附Caco－2細(xì)胞的影響相似，都能通過置換作用阻止大腸桿菌K88的黏附，相對置換率分別為:42.51%、21.07%、52.49%和37.85%，其中乳酸菌L1、L3和L4的大腸桿菌K88黏附率均極顯著降低(P＜0.01)。相反，競爭試驗或者排斥試驗總體上能促進(jìn)大腸桿菌K88對腸上皮細(xì)胞的黏附作用。乳酸菌L5在競爭、排斥和置換試驗中都能促進(jìn)大腸桿菌K88的黏附，乳酸菌L6則能夠通過競爭和置換作用降低大腸桿菌K88的黏附，相對降低率分別為6.43%和47.86%?？梢姡樗峋鷮Υ竽c桿菌K88的黏附影響沒有菌屬特異性，而且與乳酸菌自身的黏附力也沒有必然聯(lián)系。

2.3 益生乳酸菌對鼠傷寒沙門氏菌黏附Caco-2細(xì)胞的影響

由表2可知，所有的乳酸菌都能夠通過置換作用減少鼠傷寒沙門氏菌的黏附，乳酸菌L1～L6相對置換率分別為27.38%、11.59%、50.53%、23.16%、57.91%和36.84%，其中 L1、L3～L6的鼠傷寒沙門氏菌黏附率極顯著降低(P＜0.01)。除了L3外，其他5株益生乳酸菌都通過競爭作用顯著(P＜0.05)或極顯著地(P＜0.01)促進(jìn)其黏附，且所有的乳酸菌都通過排斥作用極顯著促進(jìn)其對Caco－2細(xì)胞的黏附(P＜0.01)。這表明置換作用是這6株乳酸菌阻止鼠傷寒沙門氏菌黏附Caco－2細(xì)胞的主要方式。它們對鼠傷寒沙門氏菌的黏附抑制作用沒有菌屬特異性，與乳酸菌自身的黏附力也沒有關(guān)聯(lián)。

表1 乳酸菌對大腸桿菌K88黏附Caco-2細(xì)胞的影響Table 1 Effects of lactic acid bacteria strains on adhesion ability of Escherichia coli K88 to Caco－2 cells %

表2 乳酸菌對鼠傷寒沙門氏菌黏附Caco-2細(xì)胞的影響Table 2 Effects of lactic acid bacteria strains on adhesion ability of S.typhimurium to Caco－2 cells %

3 討論

隨著抗生素在全球動物生產(chǎn)中的禁用，益生菌成為研究的熱點(diǎn)，乳酸菌作為益生菌的一種，因其能夠改善胃腸道功能、提高動物免疫力和生產(chǎn)性能等，在動物生產(chǎn)中得到了極大的推廣和應(yīng)用。對于益生菌的作用機(jī)理，目前普遍認(rèn)為黏附是其發(fā)揮益生作用的前提，也是細(xì)菌與宿主相互作用的第1步。菌群在腸道內(nèi)的定植是通過細(xì)菌的黏附作用來實(shí)現(xiàn)的，乳酸菌進(jìn)入腸道能否黏附于宿主某段腸道的黏膜細(xì)胞表面，形成穩(wěn)定的優(yōu)勢菌群，是決定這種益生素實(shí)際效果的重要因素。Gopal等［8］報道3株飼用乳酸菌菌株對人腸道上皮細(xì)胞系 HT－29、Caco－2 和 HT29－MTX 細(xì)胞有極強(qiáng)的黏附力，而且3株乳酸菌都能降低大腸桿菌O157∶H7對腸細(xì)胞的侵襲能力和細(xì)胞結(jié)合能力。陳臣等［9］研究發(fā)現(xiàn)3株乳桿菌對Caco－2細(xì)胞均有較好的黏附能力，尤其是植物乳桿菌ST－Ⅲ，其黏附率高于被深入研究的鼠李糖乳桿菌。本試驗發(fā)現(xiàn)，試驗菌株黏附率從高到低依次為乳桿菌＞腸球菌＞致病菌＞乳球菌，說明乳酸菌在體外對腸上皮細(xì)胞有較好的黏附性能，與上述報道基本一致。同時說明乳酸菌對Caco－2細(xì)胞的黏附有菌屬特異性，這與Nissen等［10］報道的結(jié)果一致。這可能與黏附素有很大的關(guān)系，黏附素是一種與黏附相關(guān)的分泌型蛋白質(zhì)，它可介導(dǎo)菌體與細(xì)胞膜受體的連接，此類分泌型蛋白質(zhì)分子的水平在很大程度上可能不盡一致，由此表現(xiàn)出乳酸菌黏附性能的差異。本試驗發(fā)現(xiàn)分離于健康雞腸道的乳桿菌L3和來源于人腸道的乳桿菌L1、L2對Caco－2細(xì)胞的黏附率沒有顯著差異。王斌等［11］認(rèn)為，乳桿菌對腸上皮細(xì)胞的黏附有宿主特異性，而與此相反，李平蘭等［12］卻發(fā)現(xiàn)，分離自人糞便與豬糞便的同屬乳酸菌黏附HT－29細(xì)胞的能力沒有顯著差異。本試驗結(jié)果提示乳酸菌的黏附可能無宿主特異性，與李平蘭等［12］的研究結(jié)果一致，但要確定乳酸菌是否具有宿主特異性還需進(jìn)一步的試驗驗證。本試驗發(fā)現(xiàn)幾乎所有乳酸菌均能通過置換作用抑制大腸桿菌K88和鼠傷寒沙門氏菌對腸上皮細(xì)胞的黏附，但是通過競爭作用和排斥作用不但不能抑制反而促進(jìn)病原菌的黏附。雖然不同種屬和菌株的益生乳酸菌對腸道致病菌的黏附抑制作用不同［13］，但是很多益生乳酸菌抑制腸致病菌黏附腸上皮細(xì)胞都是通過排斥、競爭或置換作用實(shí)現(xiàn)。Matija?ic'等［14］研究發(fā)現(xiàn)，格氏乳桿菌通過排斥和競爭作用抑制大腸桿菌K88黏附Caco－2細(xì)胞。郭彤等［15］報道，嗜酸乳桿菌能夠通過排斥、競爭或置換作用明顯抑制大腸桿菌K88和豬霍亂沙門氏菌黏附 Caco－2 細(xì)胞。Tuomola 等［16］和 Collado等［17］分別報道過乳酸桿菌和雙歧桿菌對病原菌黏附的促進(jìn)作用，但具體原因尚不清楚。但是體外細(xì)胞試驗是在人為的簡單的環(huán)境中進(jìn)行，與體內(nèi)真實(shí)復(fù)雜的環(huán)境還是有區(qū)別的。在宿主的腸道內(nèi)，腸上皮細(xì)胞表面還覆蓋有一層由一些糖蛋白類物質(zhì)組成的黏液層，黏蛋白是其中主要的一種糖蛋白，其上分布有腸菌群的一些特異性結(jié)合位點(diǎn)。益生菌的黏附特點(diǎn)可能與其細(xì)胞壁成分或代謝產(chǎn)物有關(guān)。益生細(xì)菌細(xì)胞壁的成分(如脂膜酸)及其含量或者代謝物質(zhì)及其分泌量，以及細(xì)菌表面的特性都影響其黏附力［18－19］，從而導(dǎo)致其對病原菌黏附性能的影響不同。Mangell等［20］認(rèn)為有黏附力的益生菌不容易因腸蠕動而隨食糜排出體外，從而容易在腸道中定植，構(gòu)成抵抗致病菌入侵的微生物屏障，發(fā)揮更持久的保護(hù)作用。因此，黏附力一直是受人關(guān)注的腸道益生菌特性之一。本試驗中的乳酸菌菌株黏附性能較好，但是關(guān)于其對病原菌的黏附抑制作用及其乳酸菌的黏附是否具有宿主特異性還有待進(jìn)一步研究以得到更加明確的結(jié)果。對于乳酸菌的黏附機(jī)理也還需要進(jìn)一步的研究，以期能在動物生產(chǎn)上更好地利用黏附特性來挑選乳酸菌進(jìn)行生產(chǎn)試驗，從而對其提高動物機(jī)體免疫力的能力有更好的評價。

4 結(jié)論

①乳酸菌對腸上皮細(xì)胞有較高的黏附率，尤其是乳桿菌。

②乳酸菌對腸上皮細(xì)胞的黏附有菌屬特異性。

③乳酸菌對大腸桿菌K88和鼠傷寒沙門氏菌的黏附抑制作用主要通過置換方式，但沒有菌屬特異性，且與自身的黏附力也沒有必然的聯(lián)系。

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