周向麗 劉大程* 孫 鴿 高 民 胡紅蓮

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，呼和浩特 010018;2.內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，呼和浩特 010030)

近些年隨著高精料飼糧的大量使用，反芻動物的生產(chǎn)性能得到了極大的提高。這種以淀粉為能量來源高精料飼糧的大量使用極易導(dǎo)致瘤胃酸中毒等代謝性疾病的發(fā)生［1］。正常情況下，反芻動物瘤胃發(fā)酵產(chǎn)生的揮發(fā)性脂肪酸(VFA)大多被瘤胃上皮細(xì)胞吸收［2］，而瘤胃對VFA的吸收是一個被動過程，位于瘤胃壁上的瘤胃乳頭可增強(qiáng)此被動吸收過程［3］，因此，增加瘤胃乳頭長度和表面積可增強(qiáng)其對VFA的吸收，在一定程度上避免了VFA堆積。飼糧的營養(yǎng)水平會影響胰島素樣生長因子Ⅰ(insulin－like growth factor Ⅰ，IGF－Ⅰ)的基因表達(dá)和濃度。高營養(yǎng)飼糧能夠增加瘤胃上皮細(xì)胞胰島素樣生長因子Ⅰ受體(IGF－Ⅰ receptor，IGF－ⅠR)的基因表達(dá)，同時(shí)血液中IGF－Ⅰ的濃度也顯著高于低營養(yǎng)飼糧組［4］。與此同時(shí)許多體內(nèi)外試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)反芻動物瘤胃上皮生長發(fā)育受IGF－Ⅰ等激素或生長因子的調(diào)節(jié)。IGF－Ⅰ具有調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝，促進(jìn)細(xì)胞生長、分化和分裂以及抑制細(xì)胞死亡的作用。此外，IGF－Ⅰ又可促進(jìn)體外培養(yǎng)的山羊瘤胃上皮細(xì)胞DNA合成［4］。因此一些學(xué)者推斷高營養(yǎng)飼糧可經(jīng)IGF－Ⅰ系統(tǒng)增加瘤胃上皮乳頭的數(shù)量及大?。?］。目前，關(guān)于亞急性瘤胃酸中毒(SARA)發(fā)生、發(fā)展過程中，瘤胃上皮細(xì)胞IGF－Ⅰ和IGF－ⅠR的基因表達(dá)量變化以及SARA過程中IGF－Ⅰ與瘤胃上皮生長之間存在的聯(lián)系，鮮見報(bào)道。因此，本試驗(yàn)在逐漸增加飼糧非纖維性碳水化合物和中性洗滌纖維比(NFC/NDF)誘導(dǎo)奶山羊發(fā)生SARA的基礎(chǔ)上，采用實(shí)時(shí)定量 PCR(qRTPCR)技術(shù)研究SARA發(fā)生、發(fā)展過程中瘤胃上皮細(xì)胞IGF－Ⅰ及IGF－ⅠR的基因表達(dá)量的變化。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動物與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選用12只體況良好的泌乳期關(guān)中奶山羊，平均體重30～35 kg，年齡2～3歲。整個試驗(yàn)期，試驗(yàn)動物單籠飼養(yǎng)，每天06:00和18:00 2次等量飼喂，自由飲水。

試驗(yàn)飼糧參照NRC(1981)山羊營養(yǎng)需求［6］和文獻(xiàn)［7］配制，以玉米、豆粕、麥麩、青干草為主要原料。試驗(yàn)分4期進(jìn)行，每期15 d，依次飼喂NFC/NDF為1.02(Ⅰ期)、1.24(Ⅱ期)、1.63(Ⅲ期)、2.58(Ⅳ期)的4組飼糧誘導(dǎo)奶山羊發(fā)生SARA。試驗(yàn)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。

1.2 樣品采集與處理

試驗(yàn)分4期進(jìn)行，通過觀察動物的精神狀態(tài)、采食量及糞便的變化等判定動物發(fā)生酸中毒，SARA誘導(dǎo)成功。在每期試驗(yàn)結(jié)束后，選3只奶山羊宰殺取樣，每只羊取3個平行樣。所有山羊宰殺前禁食12 h，奶山羊屠宰后，迅速打開瘤胃，為了便于定位每次采取后腹盲囊靠近后溝處組織，鈍性分離其黏膜，生理鹽水洗凈表層瘤胃內(nèi)容物后，剪成糊狀裝入1支1.5 mL離心管，迅速置于液氮中保存，后轉(zhuǎn)于－80℃冰箱保存，用于qRTPCR定量分析。

表1 試驗(yàn)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of experimental diets(air－dry basis) %

1.3 瘤胃上皮細(xì)胞總RNA的提取

用總RNA提取試劑盒［天根生化科技(北京)有限公司］提取瘤胃上皮細(xì)胞總RNA并用紫外分光光度計(jì)測定吸光度，以O(shè)D260nm/OD280nm來判斷提取總RNA的純度。

1.4 cDNA第1鏈的合成

定量取山羊瘤胃組織總RNA為模板，建立反轉(zhuǎn)錄PCR檢測方法。以oligo(dT)18引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成 cDNA第1鏈，采用20 μL反應(yīng)體系，組成如下:總 RNA 5～500 ng、Anchored Oligo(dT)18(0.5 μg/μL)1 μL、2 × TS Reaction Mix 10 μL、TransScript RT/RI Enzyme Mix 1 μL，加RNase－free Water至 20 μL。

1.5 目標(biāo)片斷的擴(kuò)增與鑒定

3對特異性引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)［8］，所有引物均由大連寶生物有限公司合成，引物序列及參數(shù)見表2。反應(yīng)使用反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司。25 μL反應(yīng)體系如下:模板cDNA 3 μL、上游和下游引物(10 μmol/L) 各 0.5 μL、2 × TransTaq－T PCR SuperMix 12.5 μL，加雙蒸水至 25 μL。

反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增參數(shù)如下:94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，退火溫度(表2)下退火30 s，72℃延伸45 s，32個循環(huán);72℃最終延伸7 min。

產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表2 引物序列及參數(shù)Table 2 Sequences and parameters of primers

1.6 目的片段膠回收、克隆及鑒定

用膠回收試劑盒［天根生化科技(北京)有限公司］對反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，按照pEASY－T1 Cloning Kit試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)將3個膠回收片段分別與pEASY－T1載體連接，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞(Trans1－T1 Phage Resistant)，隨機(jī)挑取幾個白色菌落，分別以其裂解液為模板，用上述引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增，其反應(yīng)體系和反應(yīng)條件均與1.5相同，用2.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴(kuò)增片段的大小以鑒定重組質(zhì)粒。挑選反轉(zhuǎn)錄PCR鑒定陽性菌落分別接種于1 mL含有 1.4 μL 氨芐青霉素(Amp，100 μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，送至大連寶生物有限公司進(jìn)行測序。

1.7 重組質(zhì)粒的提取及qRT-PCR

用質(zhì)粒提取試劑盒(美國AXYGEN公司)提取含有目的片段的重組質(zhì)粒，使用微量紫外分光光度計(jì)(德國Eppendorf公司)測定質(zhì)粒DNA溶液的濃度，將提取的質(zhì)粒進(jìn)行10倍系列稀釋，制備10～105拷貝的反應(yīng)用模板共5個梯度濃度，用Premix Ex TaqTM試劑盒(日本TaKaRa公司)配制25 μL 反應(yīng)體系，組成如下:模板 cDNA 3 μL、SYBRB Premix Ex TaqTMⅡ(2 ×)12.5 μL、上游和下游引物(10 μmol/L)各 0.5 μL、8.5 μL 雙蒸水。

美國Bio－Rad公司 iQTM5多重 qRT－PCR儀上進(jìn)行qRT－PCR擴(kuò)增，反應(yīng)參數(shù)如下:95℃預(yù)變性30 s;95℃變性10 s，退火溫度(表2)下退火30 s，72℃延伸30 s(收集熒光)，40個循環(huán)。

反應(yīng)結(jié)束后軟件自動繪制以拷貝數(shù)的對數(shù)為橫坐標(biāo)，以qRT－PCR反應(yīng)過程中到達(dá)熒光閾值的初始循環(huán)數(shù)(Ct)為縱坐標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.8 樣品DNA的測定

獲得樣品Ct，計(jì)算相對表達(dá)量。計(jì)算公式［9］如下:

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 17.0軟件ANOVA過程進(jìn)行方差分析，多重比較用Duncan氏法。

2 結(jié)果與分析

2.1 瘤胃上皮細(xì)胞總RNA的提取及質(zhì)量檢測

提取的總RNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測，其OD260nm/OD280nm在1.8～2.0之間，說明提取的總RNA有較好的純度。經(jīng)2.0%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定樣品總RNA的完整性，如圖1所示，18S和28S條帶清晰，無DNA污染，無明顯降解，表明提取的總RNA質(zhì)量較高。

圖1 RNA凝膠電泳圖譜Fig.1 Agarose gel image of total RNA

2.2 目標(biāo)片段擴(kuò)增與序列分析

用2.0%瓊膠糖凝膠電泳檢測，反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增產(chǎn)物專一且內(nèi)參 β－肌動蛋白、IGF－Ⅰ和IGF－ⅠR目標(biāo)片段大小分別在330、393和215 bp(圖2、圖3和圖4)。每種引物實(shí)際擴(kuò)增片段大小與預(yù)期目的片段大小相符。將這3種反轉(zhuǎn)錄PCR產(chǎn)物回收、克隆、陽性重組質(zhì)粒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄PCR，擴(kuò)增出的條帶與目標(biāo)片段大小一致(圖5)。

2.3 熔解曲線分析

內(nèi)參β－肌動蛋白、IGF－Ⅰ和IGF－ⅠR的基因的熔解曲線各只有1個特異性峰(圖6)，表明無引物二聚體及非特異性產(chǎn)物形成，說明所設(shè)計(jì)引物有很好的特異性，PCR反應(yīng)條件得到了較好的優(yōu)化。

圖2 β-肌動蛋白反轉(zhuǎn)錄PCR電泳檢測結(jié)果Fig.2 Reverse transcription PCR electrophoresis results of β－actin

圖3 IGF-Ⅰ反轉(zhuǎn)錄PCR電泳檢測結(jié)果Fig.3 Reverse transcription PCR electrophoresis results of IGF－Ⅰ

圖4 IGF-ⅠR反轉(zhuǎn)錄PCR電泳檢測結(jié)果Fig.4 Reverse transcription PCR electrophoresis results IGF－ⅠR

圖5 含有目的片段的質(zhì)粒反轉(zhuǎn)錄PCR電泳結(jié)果Fig.5 Reverse transcription PCR electrophoresis results of plasmids with target fragments

2.4 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建

經(jīng)紫外分光光度計(jì)測定β－肌動蛋白、IGF－Ⅰ和IGF－ⅠR質(zhì)粒DNA溶液的濃度分別為31、29和34 μg/mL。qRT－PCR儀中軟件自動生成的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增反應(yīng)曲線，Ct和拷貝數(shù)呈線性關(guān)系，所構(gòu)建的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品起始模板為10～105，繪制出的拷貝數(shù)log值(y)和Ct(x)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程分別為:β－肌動蛋白，y= －3.283x+24.874(R2=0.992);IGF－Ⅰ，y= － 3.637x+29.076(R2=0.995);IGF－ⅠR，y= － 3.935x+22.893(R2=0.997)。表明拷貝數(shù)的Log值與Ct之間的線性關(guān)系良好，其他非特異性反應(yīng)產(chǎn)生的雙鏈干擾較少，所建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線符合qRT－PCR定量的要求。

圖6 β-肌動蛋白、IGF-Ⅰ和IGF-ⅠR熔解曲線Fig.6 Melting curves of β－actin，IGF－Ⅰ and IGF－ⅠR

2.5 IGF-Ⅰ和IGF-ⅠR定量分析結(jié)果

本試驗(yàn)用qRT－PCR分別檢測出各組目的基因和內(nèi)參基因的Ct(表3)，代入公式進(jìn)行相對定量(表4)。隨著 NFC/NDF的逐漸增大，IGF－Ⅰ和IGF－ⅠR的基因表達(dá)量均呈現(xiàn)不同程度的增加，且二者表達(dá)量的變化趨勢具有很好的一致性。以Ⅰ期瘤胃中的IGF－Ⅰ和IGF－ⅠR的基因表達(dá)量作為對照，Ⅱ期IGF－Ⅰ和 IGF－ⅠR的基因表達(dá)量分別是Ⅰ期的1.70和1.88倍，2組之間無顯著差異(P ＞0.05)。Ⅲ期較Ⅱ期相比，IGF－Ⅰ和 IGF－ⅠR的基因表達(dá)量出現(xiàn)顯著增加(P＜0.05)，且分別是Ⅰ期的2.71和3.09倍。Ⅳ期(SARA期)較Ⅲ期相比，IGF－Ⅰ和IGF－ⅠR的基因表達(dá)量分別出現(xiàn)極顯著(P＜0.01)和顯著(P＜0.05)增加，且分別是Ⅰ期的9.61和10.19倍，極顯著高于Ⅰ期(P＜0.01)。

3 討論

qRT－PCR技術(shù)目前已成為一種被廣泛用于對未知模板進(jìn)行定量分析的必要手段。本試驗(yàn)在測定不同飼糧NFC/NDF條件下，奶山羊瘤胃上皮細(xì)胞IGF－Ⅰ和IGF－ⅠR的基因表達(dá)量時(shí)，通過特異性引物的設(shè)計(jì)、反應(yīng)體系的優(yōu)化等，使目的熔解曲線只有1個特異性峰，由此說明試驗(yàn)過程中沒有引物二聚體及其他非特異性產(chǎn)物的生成，進(jìn)而保證qRT－PCR反應(yīng)的高質(zhì)量。試驗(yàn)結(jié)果得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線R2均在0.990以上，表明拷貝數(shù)的log值與Ct之間的線性關(guān)系良好，其他非特異性雙鏈干擾較少。結(jié)果表明，目的片段成功制備、重組并保持了序列的完整性和特異性，為qRT－PCR表達(dá)檢測的順利進(jìn)行奠定了良好的基礎(chǔ)。

表3 qRT-PCR所測的各樣品的CtTable 3 The Ct values of samples determined by the qRT－PCR

表4 IGF-Ⅰ和IGF-ⅠR qRT-PCR定量結(jié)果Table 4 The results of qRT－PCR of IGF－Ⅰ and IGF－ⅠR

IGF－Ⅰ是一種合成代謝激素，在動物體內(nèi)各組織器官中均有該基因的表達(dá)產(chǎn)物，可促進(jìn)細(xì)胞對氨基酸和葡萄糖的攝取，增加蛋白質(zhì)、脂肪和糖原合成，刺激DNA復(fù)制和細(xì)胞增殖分化，對許多組織細(xì)胞增殖、分化起調(diào)節(jié)作用，是動物生長發(fā)育過程中一種重要的生長因子。IGF－Ⅰ的功能主要依靠與IGF－ⅠR結(jié)合來執(zhí)行，IGF－ⅠR廣泛分布于多種組織及培養(yǎng)細(xì)胞中，在新生犢牛瘤胃上皮細(xì)胞［10］和青年山羊瘤胃上皮細(xì)胞均存在 IGF－Ⅰ和IGF－ⅠR的基因表達(dá)。IGF－Ⅰ的基因表達(dá)受到生長激素、營養(yǎng)狀態(tài)等因素的調(diào)控，營養(yǎng)素對IGF－Ⅰ具有直接調(diào)控作用，飼糧中蛋白質(zhì)水平對IGF－Ⅰ的基因表達(dá)有顯著影響，營養(yǎng)不良時(shí)，肝臟、肌肉等組織中 IGF－Ⅰ的基因表達(dá)發(fā)生變化，血液中IGF－Ⅰ水平降低［11－12］。飼糧蛋白質(zhì)水平低于生長需要時(shí)，大鼠［13］及肥育豬［14］血漿 IGF－Ⅰ濃度均下降。本試驗(yàn)結(jié)果顯示隨著飼糧NFC/NDF增高，即飼糧營養(yǎng)水平逐漸增加時(shí)，瘤胃上皮細(xì)胞中IGF－Ⅰ和IGF－ⅠR的基因表達(dá)量均呈現(xiàn)不同程度的增加，特別是在NFC/NDF為2.58時(shí)，IGF－Ⅰ的基因表達(dá)量是試驗(yàn)初期的9.61倍，而IGF－ⅠR的基因表達(dá)量也是試驗(yàn)初期的10.19倍，這不僅說明高營養(yǎng)飼糧有利于促進(jìn)瘤胃上皮細(xì)胞IGF－Ⅰ的基因表達(dá)，同時(shí)也說明IGF－Ⅰ和 IGF－ⅠR的基因表達(dá)具有很好的一致性，這有助于IGF－Ⅰ更好的發(fā)揮其生物學(xué)功效。

IGF－Ⅰ對動物胃腸道的發(fā)育和更新具有重要的調(diào)節(jié)作用?？诜亟M人胰島素樣生長因子Ⅰ(rhIGF－Ⅰ)有助于新生反芻動物胃腸道的生長發(fā)育。而體外培養(yǎng)的瘤胃上皮細(xì)胞經(jīng)IGF－Ⅰ處理后，細(xì)胞分裂加快，細(xì)胞DNA合成增多，促進(jìn)了細(xì)胞增殖。體內(nèi)外試驗(yàn)都表明IGF－Ⅰ對瘤胃上皮的生長發(fā)育具有促進(jìn)作用。本試驗(yàn)結(jié)果中IGF－Ⅰ和IGF－ⅠR的基因表達(dá)量隨飼糧NFC/NDF的增加而增加。試驗(yàn)過程中，由于瘤胃體積較大，取材部位與取材標(biāo)準(zhǔn)會對試驗(yàn)產(chǎn)生很大影響，因此在取材的過程中為統(tǒng)一定位，每次采取瘤胃后腹盲囊靠近后溝處組織作為研究對象。在此過程中我們發(fā)現(xiàn)前2期瘤胃上皮乳頭的長度和密度沒有明顯的區(qū)別，瘤胃黏膜上密布著棕褐色扁平而凸起的乳頭。到Ⅲ期時(shí)，視覺上可見瘤胃上皮乳頭長度比Ⅰ、Ⅱ期有所增加，乳頭密度沒有太大變化，但Ⅳ期時(shí)，瘤胃上皮乳頭長度與前幾期相比變短，乳頭密度變稀疏，且在某些部位出現(xiàn)損傷和脫落現(xiàn)象。之前報(bào)道IGF－Ⅰ具有促進(jìn)瘤胃上皮乳頭生長的作用，而本試驗(yàn)出現(xiàn)的這種結(jié)果與之相反。由課題組前期研究可知出現(xiàn)瘤胃上皮損傷的主要原因是飼糧 NFC/NDF為2.58時(shí)，試驗(yàn)動物發(fā)生SARA，瘤胃內(nèi)VFA大量堆積，瘤胃液pH急劇下降［15］，瘤胃上皮細(xì)胞長時(shí)間浸潤在高滲和低 pH環(huán)境下導(dǎo)致的。而此時(shí)瘤胃上皮細(xì)胞IGF－Ⅰ和IGF－ⅠR的基因表達(dá)量均大大增加，有利于瘤胃上皮細(xì)胞對VFA的吸收，也可能是瘤胃內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定性遭到破壞時(shí)動物機(jī)體的一種代償表現(xiàn)。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)，SARA狀態(tài)時(shí)，丁酸濃度顯著升高是導(dǎo)致瘤胃總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)濃度升高的主要因素，瘤胃中VFA蓄積增多對SARA發(fā)生起著決定性作用。當(dāng)給瘤胃灌注丁酸后，血漿胰島素濃度升高，瘤胃上皮細(xì)胞分裂增強(qiáng)［16］。因此推測丁酸濃度的增加可能會刺激瘤胃上皮細(xì)胞IGF－Ⅰ和IGF－ⅠR的基因表達(dá)，以促進(jìn)瘤胃上皮細(xì)胞生長并且增加瘤胃上皮細(xì)胞對丁酸的吸收，以此來減弱酸性環(huán)境對瘤胃的損傷。

4 結(jié)論

以提高飼糧NFC/NDF的方法逐漸誘導(dǎo)SARA，IGF－Ⅰ及 IGF－ⅠR 的基因表達(dá)量顯著提高，SARA發(fā)生后，它們的表達(dá)量有大幅增加。

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