王 靖，李 俊，吳學(xué)東，王 寧

(1大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理671000;2大理學(xué)院附屬醫(yī)院)

獲得性漏斗胸膈肌肌凝蛋白重鏈MyHC-Ⅰ的表達(dá)變化和意義

王 靖1，李 俊2，吳學(xué)東2，王 寧2

(1大理學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理671000;2大理學(xué)院附屬醫(yī)院)

目的 通過檢測獲得性漏斗胸大鼠膈肌肌凝蛋白重鏈MyHC-Ⅰ的表達(dá)變化，探討肌凝蛋白重鏈在獲得性漏斗胸發(fā)生發(fā)展中的作用。方法 選用4周齡SD大鼠48只，隨機(jī)分為3組，每組16只。其中肋軟骨組和膈肌組分別為從胸骨旁切斷下位3對肋軟骨并造成膈肌局部物理損傷而獲得漏斗胸模型，對照組不做任何干預(yù)。于術(shù)后第2周和第4周每組各處死大鼠8只，收集膈肌組織，分別進(jìn)行RT-PCR定量和Western blot檢測。結(jié)果 肋軟骨組和膈肌組動物均呈現(xiàn)前胸壁凹陷畸形。與對照組比較，肋軟骨組和膈肌組各時間點MyHC-Ⅰ表達(dá)均升高(P＜0．05);但肋軟骨組和膈肌組組間比較，僅術(shù)后第2周時MyHC-Ⅰ表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05)。結(jié)論 獲得性漏斗胸動物膈肌肌凝蛋白重鏈MyHC-Ⅰ表達(dá)增高，說明在動物漏斗胸畸形形成過程中膈肌功能發(fā)生了改變。

獲得性漏斗胸;膈肌;肌凝蛋白重鏈

漏斗胸(PE)是人類最常見的前胸壁凹陷性畸形，呈漏斗狀。其發(fā)病率為1/300～1/1 000，約占胸壁畸形的87%［1］。近年來，PE的手術(shù)治療效果有了明顯提高，但其病因和發(fā)病機(jī)制的研究一直未取得明顯進(jìn)展。在PE的研究過程中曾提出過多種病因假說［1］，膈肌發(fā)育異常就是其中較為重要的一種，但尚未得到充分證實。我們于2010年9月～2011年6月進(jìn)行本研究，通過不同造模方法獲得PE動物模型，并對其膈肌肌凝蛋白重鏈(MyHC)亞型MyHC-Ⅰ的表達(dá)進(jìn)行分析，旨在探討膈肌MyHC與獲得性PE發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

1 材料與方法

1．1 材料與試劑 SD大鼠購自中山大學(xué)實驗動物中心，生化試劑購自Amresco公司，TRIzol購自Invitrogen公司，F(xiàn)irst Strand cDNA Synthesis Kit購自Fermentas公司，熒光定量 PCR試劑盒(SYBR Green)購自TaKaRa公司，ECL顯色液、MYH7單抗購自Santa Cruz公司。

1．2 獲得性PE動物模型的建立 選用同批不同窩4周齡SD大鼠48只，隨機(jī)分為3組，每組16只，其中第1組從胸骨旁切斷下位3對肋軟骨(肋軟骨組)，第2組經(jīng)右側(cè)膈肌臟面向肌性部分注射95%乙醇造成局部物理損傷(膈肌組)，第3組對照組不做任何干預(yù)。觀察并記錄動物發(fā)育及胸壁外觀的變化。然后分別于術(shù)后第2周和第4周采用頸椎脫臼法每組各處死8只大鼠，取大鼠完整膈肌，用冰生理鹽水沖洗后放入液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1．3 RT-PCR檢測MyHC-ⅠmRNA水平 切取大鼠膈肌組織，按TRIzol Reagent說明書提取總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄得到 cDNA。采用染料法(SYBR GreenⅠ)進(jìn)行相對定量分析，實驗在ABI7300熒光定量PCR儀上進(jìn)行，內(nèi)參為大鼠GAPDH。定量引物為: MyHC-Ⅰ-F:5'-CAGGCGGAACAAGACAAC-3';My-HC-Ⅰ-R:5'-TCTCGGTCATCTCCTTCAC-3';擴(kuò)增長度為 100bp。GAPDH-F:5'-AAGTTCAACGGCACAGTCAAG-3';GAPDH-R:5'-CATACTCAGCACCAGCATCAC-3';擴(kuò)增長度為121 bp。

1．4 Western blot檢測MyHC-Ⅰ表達(dá)水平 切取大鼠膈肌組織，采用改良的提取方法［2］進(jìn)行總蛋白提取，用蛋白定量試劑盒檢測所得總蛋白濃度后，每孔加樣100 μg，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)膜，用封閉液4℃封閉過夜，加入1∶200稀釋的一抗4℃孵育12 h，二抗室溫孵育2 h，化學(xué)發(fā)光按操作說明進(jìn)行。

1．5 統(tǒng)計學(xué)方法 基因的相對表達(dá)水平用與GAPDH基因的相對水平表示。采用SPSS17．0軟件進(jìn)行單因素ANOVA分析，以P≤0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 PE動物模型觀察結(jié)果 肋軟骨組接受造模手術(shù)后動物胸壁的改變與文獻(xiàn)報道［2］一致，膈肌組結(jié)果也相似，呈明顯的前胸壁凹陷畸形，術(shù)后4周畸形程度已經(jīng)基本穩(wěn)定。因此，2組均成功獲得PE畸形動物模型。

2．2 定量檢測結(jié)果 見表1。

表1 熒光定量檢測MyHC-Ⅰ表達(dá)水平(n=8，珔x±s)

2．3 Western blot檢測結(jié)果 實驗組中MyHC-Ⅰ表達(dá)水平較對照組升高，且組中樣品間差異不明顯。見圖1。

圖1 Western blot檢測MyHC-Ⅰ于4周時的表達(dá)

3 討論

PE是最常見的前胸壁畸形，常導(dǎo)致患者心肺功能損害和心理障礙［3］，中重度者需手術(shù)矯正，盡管經(jīng)過近100年的臨床探索取得了豐碩的臨床成果，但其病因和發(fā)病機(jī)制一直未能取得明顯進(jìn)展，這在很大程度上制約著臨床對PE本質(zhì)的認(rèn)識和防治措施的研究，也嚴(yán)重制約著臨床治療的進(jìn)一步深入。

針對PE的研究已提出多種病因假說或?qū)W說，膈肌發(fā)育異常就是其中之一。1953年Brodkin提出膈肌功能性異常理論，認(rèn)為部分前方膈肌發(fā)生肌肉纖維化，引起吸氣時膈肌的異常攣縮而過度牽拉胸壁，從而導(dǎo)致前胸壁的凹陷或凸起畸形。但是Brodkin的假說不能解釋所有PE的形成，部分前方膈肌肌肉纖維化可能只是形成 PE的部分原因［1］。Theerthakarai等［4］也認(rèn)為PE是由于膈肌前半部發(fā)育異常，膈肌與胸骨下段之間存在纖維索，纖維索向后牽拉胸骨而形成。但膈肌發(fā)育異常理論尚未得到充分證實。

在整個呼吸活動中膈肌是最大的吸氣肌，膈肌收縮所產(chǎn)生的通氣量占靜息通氣量的 60% ～80%［5］。如果因某種因素而導(dǎo)致呼吸功能改變，則膈肌將成為最敏感的靶器官之一，繼之可能發(fā)生形態(tài)和功能的變化。PE的研究［1，5］都提示，在胸廓的完整性遭到破壞和胸壁軟化基礎(chǔ)上，呼吸肌特別是膈肌的收縮和牽拉在其發(fā)生中可能發(fā)揮著重要的作用。為了維持機(jī)體的氧需要，膈肌的負(fù)荷增加，直接的表現(xiàn)是膈肌舒縮頻率增快、舒縮幅度加大，隨之而來的將可能是膈肌代償性肥厚、功能增強(qiáng)，功能增強(qiáng)后的膈肌對脆弱的前下胸壁的牽拉作用增強(qiáng)，將可能使胸壁在非正常形態(tài)下重新塑形。因而研究PE中膈肌的適應(yīng)性變化將有助于闡明膈肌在PE發(fā)生中的作用機(jī)制。

膈肌在組織學(xué)上屬于骨骼肌，而肌纖維是構(gòu)成骨骼肌的基本單位。肌凝蛋白是肌纖維中最主要的收縮蛋白，由兩條肌凝蛋白重鏈和兩對具有ATPase活性的肌凝蛋白輕鏈組成。肌纖維類型的不同和其收縮特性是由肌凝蛋白重鏈所決定的［6］，因此膈肌的舒縮功能同樣受肌凝蛋白重鏈的調(diào)節(jié)，膈肌病理情況下的代償作用與膈肌中不同表型的肌凝蛋白及其異構(gòu)體組分改變關(guān)系密切［7］。研究表明，骨骼肌MyHC的表達(dá)受生長發(fā)育中多種因素的影響，且MyHC亞型表達(dá)的轉(zhuǎn)變遵循ⅠⅡaⅡxⅡb的專一途徑［8］。對骨骼肌的研究發(fā)現(xiàn)，膈肌負(fù)荷的慢性增加會引起低ATP酶活性的慢型MyHC積聚和高ATP酶活性的快型MyHC減少，且這種轉(zhuǎn)換會隨呼吸功能惡化而增加［9］。MyHC的這種轉(zhuǎn)變與降低未負(fù)荷肌肉的收縮速度和節(jié)約能耗密切相關(guān)，是病理情況下的一種有效代償。因此，研究獲得性PE膈肌MyHC-Ⅰ的表達(dá)變化將有助于認(rèn)識PE發(fā)生時膈肌功能的改變情況，并對闡明膈肌在PE發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制有重要意義。

本研究按照吳學(xué)東等［5］的方法建立了肋軟骨組PE大鼠模型，肋軟骨的損傷會造成維持正常胸廓形狀的完整肋骨環(huán)結(jié)構(gòu)被破壞，致使其抵抗胸內(nèi)負(fù)壓和呼吸肌牽拉的作用喪失，而導(dǎo)致胸廓畸形發(fā)生。同時，通過注射95%乙醇造成膈肌物理損傷的方式獲得了生長發(fā)育期大鼠前胸壁凹陷畸形模型。在此基礎(chǔ)上，分別于術(shù)后不同時間點取動物膈肌組織進(jìn)行研究。通過熒光定量和Western blot檢測發(fā)現(xiàn):第2周和第4周兩實驗組的MyHC-Ⅰ表達(dá)均較正常對照組升高，說明在動物PE畸形形成過程中膈肌慢型肌纖維成分增加，膈肌收縮力減弱。2周時膈肌組的MyHC-Ⅰ表達(dá)較肋軟骨組更高，4周時無明顯差異，這可能是由于膈肌物理損傷造成膈肌瘢痕修復(fù)，導(dǎo)致膈肌肌纖維成分改變，進(jìn)一步影響抗彎曲能力較弱的肋軟骨，從而使前胸壁重新塑形，形成前胸壁凹陷畸形，從而使胸腔的整體容積減小，肺的擴(kuò)張受到抑制，尤其是吸氣時肺擴(kuò)張受限，阻力增加，出現(xiàn)限制性呼吸困難，為保證機(jī)體氧氣供應(yīng)量，膈肌的負(fù)荷增加，發(fā)生疲勞，膈肌肌纖維出現(xiàn)適應(yīng)性改變，即Ⅰ型(慢型)同源蛋白表達(dá)增加，故MyHC-Ⅰ表達(dá)并沒有因為幼鼠的生長發(fā)育而恢復(fù)到正常水平，而是作出了適應(yīng)性的變化。而我們之前的研究結(jié)果［10］提示，相同觀測時點上模型動物膈肌MyHC-Ⅱa表達(dá)下降，同樣不隨幼鼠的生長發(fā)育而恢復(fù)到正常水平。

綜上所述，當(dāng)動物發(fā)生前胸壁凹陷畸形時，膈肌負(fù)荷增加而發(fā)生膈肌疲勞，膈肌肌纖維出現(xiàn)適應(yīng)性改變，表現(xiàn)為MyHC-Ⅰ表達(dá)升高而MyHC-Ⅱa表達(dá)下降，慢型肌纖維成分增加而快型肌纖維減少，膈肌收縮力減弱而變得緩慢持久。膈肌肌凝蛋白重鏈組分異構(gòu)體在漏斗胸發(fā)生發(fā)展中的這一轉(zhuǎn)變模式進(jìn)一步證實呼吸道、肺和膈肌結(jié)構(gòu)改變導(dǎo)致的一系列功能異常都有可能是PE形成的原因。具體機(jī)制尚需基礎(chǔ)與臨床的進(jìn)一步研究和探索。

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2011-11-12)

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