楊紹敏，樊移山，李惠琴，高 麗，楊壁琿，張 米，李正倫，周曾全

(云南省傳染病?？漆t(yī)院艾滋病關(guān)愛中心檢驗科，云南 昆明 650301)

獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)合并結(jié)核病時由于免疫缺陷導(dǎo)致常規(guī)抗酸染色陽性率低[1-2]、結(jié)核菌素試驗無反應(yīng)[3]、臨床結(jié)核中毒表現(xiàn)不典型[4-5]、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)時間較長。臨床診療迫切需要實驗室提供早期、特異的病原學(xué)診斷信息。我們探討了結(jié)核分枝桿菌轉(zhuǎn)錄酶主導(dǎo)基因擴增法(TMA)直接擴增結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(MTD)RNA在AIDS合并結(jié)核病患者實驗診斷的臨床應(yīng)用。

材料和方法

一、研究對象

具有以下入組標(biāo)準(zhǔn)1條以上癥狀者即可入組。(1)持續(xù)發(fā)熱在38℃左右超過2周者;(2)頻繁咳嗽或陣發(fā)性咳嗽、咳痰超過3周者;(3)咳血或伴有血痰者;(4)有盜汗者;(5)有咽痛、胸痛超過2周者;(6)胸腔積液，胸部X線檢查異常者;(7)頭痛伴或不伴嘔吐、意識障礙者;(8)淋巴結(jié)明顯紅、腫、痛并持續(xù)發(fā)熱超過2周者;(9)胸、腹水原因不明并持續(xù)發(fā)熱超過2周者。2009年7月至2010年6月共入組152例疑似結(jié)核病待診患者。其中AIDS患者127例，男84例，女43例，年齡8～74歲。由云南省艾滋病關(guān)愛中心艾滋病確證實驗室采用免疫印跡法(WB)確證。對照組25例，男18例，女7例，年齡18～77歲，為同期內(nèi)科住院和門診非人類免疫缺陷病毒(HIV)感染但臨床疑似結(jié)核病待診患者。

二、樣本種類

經(jīng)培訓(xùn)的醫(yī)護人員規(guī)范采集臨床樣本[6]，AIDS組127例樣本均為痰液，對照組25例樣本中有3例灌洗液、3例術(shù)后痰、1例支氣管刷落物。

三、儀器和試劑

1.美國GEN-PROBE LEADER 50i化學(xué)發(fā)光檢測儀;水浴超聲震蕩儀;95、60和42℃干浴孵育器;MTD檢測試劑盒(Amplified MTD)。

2.法國梅里埃公司的BacT/ALERT 3D 360全自動培養(yǎng)儀，結(jié)核菌培養(yǎng)溫度設(shè)置為(35±1)℃，時間設(shè)定為42 d。配套的BacT/ALERT MP結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)瓶和復(fù)溶液[6]。

3.達(dá)安基因公司DA 7600聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴增儀及配套TB-DNA PCR試驗盒。

四、方法

1.樣本處理 痰樣本用 N-乙酰-L-半胱氨酸-氫氧化鈉(NALC-NaOH)進(jìn)行前處理[6-7]。處理后的樣本分為3份，在沉淀物中加入1～2 mL牛白蛋白溶液混勻，取50 μL裂解液于裂解試管中，加入經(jīng)前消化處理的樣本450 μL，混勻后置于水浴超聲震蕩器中15～20 min裂解細(xì)菌釋放rRNA用于MTD檢測，同樣方法裂解陽性、陰性質(zhì)控物;取1 mL加入3D結(jié)核瓶進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)，儀器報陽即進(jìn)行涂片萋-尼抗酸染色鏡檢及TB-DNA PCR 檢測[1，6];前處理的樣本最后進(jìn)行涂片萋-尼抗酸染色鏡檢。支氣管灌洗物等樣本置于50 mL離心管，1200×g離心15 min，棄上清，沉淀物加入pH值為6.8的磷酸鹽緩沖液(PBS)0.9 mL，同樣方法處理。

2.MTD檢測 該法采用特有的等溫酶通過DNA中間體直接擴增rRNA靶基因，操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。取樣本裂解產(chǎn)物、陽性和陰性質(zhì)控物各25 μL分別加入預(yù)置有擴增試劑50 μL及甘油200 μL的擴增管內(nèi)，95℃干浴15 min、42℃ 5 min，加入25 μL等溫酶試劑混勻后繼續(xù)擴增30 min，加入100 μL雜交試劑混勻，60℃雜交15 min;加入300 μL篩選試劑混勻60℃15 min，取出置室溫 5 min后，在 1 h內(nèi)用LEADER 50i化學(xué)發(fā)光檢測儀檢測樣本相對發(fā)光值(relative light units，RLUs)，樣本被檢測的同時rRNA也被淬滅。結(jié)果判斷:RLUs≥500000陽性，RLUs＜30000陰性，30000～499999 RLUs可能為MTD，重復(fù)試驗以驗證結(jié)果(重復(fù)試驗RLUs≥30000即可判為陽性)。要求同批檢測的陽性質(zhì)控RLUs≥1000000，陰性質(zhì)控RLUs＜20000時實驗成立[8-11]。

五、統(tǒng)計學(xué)方法

用SPSS PASW 17.0統(tǒng)計軟件中，分別采用配對χ2檢驗和Fisher確切概率法對各組陽性檢出率進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、臨床特征

AIDS組患者臨床表現(xiàn)咳嗽81.9%(104/127)，發(fā)熱 81.1%(103/127)，咳痰 47.2%(60/127)，消瘦 37.8%(48/127)，呼吸困難18.9%(24/127)，頭痛 6.3%(8/127)，胸痛4.7%(6/127)，血痰、皮疹、淋巴結(jié)腫痛各占3.9%(各 5/127)。發(fā)熱咳嗽的103例患者中鵝口瘡18例(14.2%)，合并肺孢子菌肺炎(PCP)9例(7.1%)，合并隱球菌感染1 例(0.8%)。

對照組患者咳痰、咳嗽各占88.0%(22/25)，發(fā)熱。消瘦各占32.0%(8/25)，血痰16.0%(4/25)，胸痛 12.0%(3/25)，呼吸困難 8.0%(2/25)。

二、MTD的符合率

127例AIDS患者中有32例結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性且PCR鑒定為結(jié)核分枝桿菌，MTD均為陽性;25例對照者中有11例結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性且PCR鑒定為結(jié)核分枝桿菌，MTD均為陽性，符合率為100.0%(43/43)。

三、3種方法陽性率比較

對MTD、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)和抗酸染色3種方法對AIDS組、對照組的臨床樣本檢出陽性率進(jìn)行比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義=3.670，P ＞0.05=0.113，P ＞0.05)。對 2 組不同方法進(jìn)行比較，MTD、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)檢出率在AIDS和對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義;與抗酸染色陽性率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=5.357，P＜0.05)，在AIDS組抗酸染色陽性率最低，見表1。

表1 AIDS組與對照組3種方法陽性檢出率比較 [例(%)]

四、其他病原菌檢出情況

127例AIDS患者在進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)過程中培養(yǎng)出其他細(xì)菌，經(jīng)鑒定為非結(jié)核分枝桿菌占 9.5%(12/127)、馬尼菲青霉 1.6%(2/127)、馬紅球菌1.6%(2/127)、隱球菌 0.8%(1/127)，25例對照者中未檢出非結(jié)核分枝桿菌和真菌。

討 論

結(jié)核分枝桿菌是AIDS最常見的機會性感染，也是致死的主要原因[3]。免疫缺陷致使結(jié)核分枝桿菌雙重感染的臨床表現(xiàn)呈多系統(tǒng)播散和多個臟器病變，其癥狀、體征和影像學(xué)的表現(xiàn)復(fù)雜而不典型，結(jié)核病的發(fā)熱、盜汗、消瘦、乏力、咳嗽等癥狀也常被AIDS合并其他機會性感染所掩蓋，失去了結(jié)核病原有的癥狀特征和診斷意義[6，12]。因此，病原學(xué)的診斷對臨床診療非常重要。本研究結(jié)果顯示127例AIDS患者中經(jīng)培養(yǎng)鑒定僅有25.2%(32/127)為 AIDS合并結(jié)核分枝桿菌感染。而合并鵝口瘡者占14.2%(18/127)、PCP 7.1%(9/127)，合并隱球菌感染 0.8%(1/127)，非結(jié)核分枝桿菌感染9.5%(12/127)、馬尼菲青霉感染 1.6%(2/127)。

MTD是采用等溫酶法擴增MTD rRNA，然后用一個吖啶酯標(biāo)記的核酸探針與之雜交，再經(jīng)雜交保護分析法篩選，最后以化學(xué)發(fā)光儀檢測被標(biāo)記的rRNA[8-11]。由于同一條細(xì)菌rRNA片段的含量是DNA片段的數(shù)百至數(shù)千倍，故同一樣本擴增rRNA的敏感性將大大增加，尤其對于含菌量較少的樣本，MTD法能充分顯示出其敏感性高的優(yōu)點。O'Sullivan等[11]報道了 1998年 2月至2001年10月，采用MTD方法檢測呼吸道樣本391份、非呼吸道樣本164份的結(jié)果，與結(jié)核診斷的“金標(biāo)準(zhǔn)”培養(yǎng)方法比較，敏感性及特異性分別為91.2%和93.9%。國外加拿大公共衛(wèi)生中心采用MTD診斷結(jié)核性腦膜炎，敏感性及特異性為93.8% 及99.3%。國內(nèi)重慶胸科醫(yī)院采用MTD診斷結(jié)核病的敏感性為50.7%(34/67)，特異性為96.9%(32/33)，與廣州胸科醫(yī)院的結(jié)果相同[13]。但都是用于普通結(jié)核病的診斷，目前尚無AIDS合并結(jié)核分枝桿菌診斷的報道。

由于rRNA僅存在于活的生物體內(nèi)，故MTD陽性具有結(jié)核分枝桿菌活菌診斷價值。由于rRNA為單鏈結(jié)構(gòu)，脆弱易降解，故不易造成環(huán)境污染。相比之下DNA為雙鏈結(jié)構(gòu)，穩(wěn)定、不易降解，故容易造成環(huán)境污染及假陽性結(jié)果。

本組研究中同時采用3種方法，對AIDS合并疑似結(jié)核分枝桿菌感染和非HIV感染的單純結(jié)核待診患者進(jìn)行檢測，單純結(jié)核對照組進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌檢測的陽性率基本一致，而AIDS組的陽性檢出率相差較大，抗酸染色陽性率明顯低于對照組，符合AIDS患者免疫缺陷導(dǎo)致抗酸染色陽性率偏低的特征[1]。Karstaedt等[14]1998 年報道，經(jīng)培養(yǎng)確診的421例成人肺結(jié)核患者中，HIV陰性的227例其涂陽率為79.0%，而HIV陽性的185例其涂陽率只有68.0%，2組差異有統(tǒng)計學(xué)意義。痰檢陽性率降低的原因可能與被吞噬于巨細(xì)胞內(nèi)的結(jié)核分枝桿菌抗酸性減弱或消失，致使常規(guī)抗酸染色不易檢出有關(guān)。HIV感染者如懷疑合并結(jié)核病，痰、組織液或分泌物中找不到結(jié)核分枝桿菌，需做結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)或MTD檢測以明確診斷。

結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)由于AIDS患者合并細(xì)菌、真菌等機會性感染易導(dǎo)致假陽性，并且培養(yǎng)時間相對較長;而采用MTD可以彌補培養(yǎng)法和抗酸染色法的缺陷，陽性檢出率較高。

AIDS組抗酸染色的陽性率不僅低于培養(yǎng)法和MTD，而且單純涂片抗酸染色不能區(qū)分結(jié)核分枝桿菌、非結(jié)核分枝桿菌和馬紅球菌。本組資料中有2例是馬紅球菌感染，而馬紅球菌抗酸染色呈弱陽性，若是菌含量高，在抗酸染色中依然可以報告4+、3+、2+、1+等結(jié)果。而這種情況我們只有結(jié)合TB-DNA PCR、MTD及細(xì)菌鑒定才可以排除結(jié)核分枝桿菌或非結(jié)核分枝桿菌的感染。

需要注意的是，在AIDS組有很大一部分是非結(jié)核分枝桿菌感染[9.5%(12/127)]。由本研究也可以看出，在AIDS患者中出現(xiàn)發(fā)熱、咳嗽、咳痰等結(jié)核病癥狀時，并不能排除非結(jié)核病的可能，而是應(yīng)該將非結(jié)核感染納入考慮之一。

本組資料表明，同時采用3種方法對AIDS合并結(jié)核病的病原學(xué)診斷提供了早期、特異的試驗數(shù)據(jù)，為臨床明確診斷、確定抗結(jié)核治療方案提供了及時有效的信息。由于MTD只能檢出活菌，為了排除樣本采集之后保存不當(dāng)、非結(jié)核分枝桿菌感染或其他抑制物會導(dǎo)致的假陰性或假陽性結(jié)果，建議與培養(yǎng)、涂片進(jìn)行平行檢測。

MTD是一種快速、敏感而特異的診斷結(jié)核病新的分子生物學(xué)檢測方法[15]，雖然MTD試劑價格較高，但可在1個工作日內(nèi)得到特異的病原學(xué)診斷，為明確治療方案有著非常重要的應(yīng)用價值。通過早診斷、早治療、規(guī)律、聯(lián)合全程抗結(jié)核治療，可降低醫(yī)療費用，節(jié)省整體治療和防治計劃的成本。明確的病原學(xué)診斷對有效的抗結(jié)核治療、降低AIDS合并結(jié)核病患者的死亡率都將產(chǎn)生積極的作用。

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