周俐斐 陳峰陽(yáng) 李曉譽(yù) 徐世芳 葉益萍 (浙江省腫瘤醫(yī)院，杭州310022)

T細(xì)胞經(jīng)特異抗原刺激激活，涉及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因的活化和轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞因子分泌、細(xì)胞分裂和增殖分化等過(guò)程。T細(xì)胞活化需要兩種信號(hào)，一種是TCR/CD3與抗原提呈細(xì)胞(Antigen presenting cells，APCs)表面特異的MHCⅡ抗原肽復(fù)合物結(jié)合產(chǎn)生的特異性抗原刺激信號(hào);另一種是非特異性協(xié)同刺激信號(hào)，如 CD154/CD40、CD28/B7、CD2/CD58、LFA-1(CD18)/ICAM-1(CD54)等，其中CD28/B7是最為重要的協(xié)同刺激分子，增加IL-2的產(chǎn)生，加速T細(xì)胞增殖，阻止細(xì)胞進(jìn)入無(wú)能狀態(tài)或死亡［1］。T細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程復(fù)雜多樣，雖然對(duì) Ca2+、PKC、Ras、MAP/ERK、NFAT、NF-κB 等轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有了較好的認(rèn)識(shí)，但其活化的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚未完全清楚［2］。

本實(shí)驗(yàn)中，我們?cè)隗w外用CD3/CD28共刺激小鼠T細(xì)胞活化，提取RNA后，采用“信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)現(xiàn)者”PCR芯片(Signal Transduction PathwayFinder PCR Array)，觀察了18個(gè)不同信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)的84個(gè)關(guān)鍵基因的mRNA改變情況，對(duì)T細(xì)胞活化的基因調(diào)控過(guò)程進(jìn)行了探討。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠，6周齡，18～22克，購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào):SCXK(滬)2007-0005。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購(gòu)得后飼養(yǎng)一周再進(jìn)行免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)。

1．2 主要試劑和儀器 RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自賽默飛世爾生物化學(xué)制品(北京)有限公司，臨用前加入100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素和10%胎牛血清配制成完全培養(yǎng)液;胎牛血清(無(wú)菌、無(wú)支原體、無(wú)嗜菌體)購(gòu)自杭州四季青生物工程有限公司;紅細(xì)胞裂解液購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所;T細(xì)胞純化尼龍毛柱購(gòu)自日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社;功能級(jí)純化抗小鼠CD3e和CD28抗體購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司;小鼠IL-2 ELISA檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司;Trizol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;RNeasy?MinEluteTM純化試劑盒購(gòu)自美國(guó)Qiagen公司;小鼠Signal Transduction PathwayFinder PCR Array(PAMM-014)購(gòu)自美國(guó)Superarray公司;Bio-Rad 680型酶標(biāo)儀為美國(guó)Bio-Rad公司;NanoDrop?ND-1000全波長(zhǎng)紫外/可見(jiàn)光掃描分光光度計(jì)為美國(guó)Thermo公司;ABI PRISM?7900熒光定量PCR儀為美國(guó)Applied Biosystems公司。

1．3 小鼠T淋巴細(xì)胞的分離 按文獻(xiàn)［3］方法無(wú)菌取小鼠脾臟，制成單細(xì)胞懸液;以紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，洗滌后以完全培養(yǎng)液混懸，調(diào)整濃度為1×108個(gè)/ml。以反向吸附法用尼龍毛柱純化T細(xì)胞［4］，收集細(xì)胞后以臺(tái)盼藍(lán)排斥法計(jì)數(shù)和計(jì)算存活率，以FITC-抗-CD3標(biāo)記后流式細(xì)胞儀測(cè)定T細(xì)胞的純度。細(xì)胞存活率＞95%;T細(xì)胞純度＞85%。

1．4 CD3/CD28誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖 于CD3e抗體包被的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入T細(xì)胞(2×106個(gè)/ml)和CD28抗體。37℃、5%CO2培養(yǎng)24和48小時(shí)后，分別以MTT法測(cè)定T細(xì)胞增殖程度，結(jié)果以570 nm測(cè)定的吸光度A表示。

1．5 CD3/CD28誘導(dǎo)T細(xì)胞IL-2的分泌 于CD3e(5 μg/ml)抗體包被的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入T細(xì)胞(2×106個(gè)/ml)和 CD28(1 μg/ml)抗體。37℃，5%CO2培養(yǎng)6、12、24 和48 小時(shí)后，分別收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，以ELISA法按IL-2檢測(cè)試劑盒說(shuō)明測(cè)定IL-2的含量。

1．6 CD3/CD28對(duì)T細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中基因mRNA表達(dá)的影響

1．6．1 細(xì)胞收集 于CD3e(5 μg/ml)抗體包被的24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入T細(xì)胞(2×106個(gè)/ml)和CD28(1 μg/ml)抗體。37℃，5%CO2培養(yǎng) 4 小時(shí)后，收集細(xì)胞。

1．6．2 RNA 提取和純化 Trizol提取 RNA，以DNaseⅠ消化RNA樣品，去除其中可能含有的基因組DNA。經(jīng)RNeasy?MinEluteTM純化試劑盒純化后的RNA，分別以變性瓊脂糖凝膠電泳和紫外吸收測(cè)定法觀察28S、18S核糖體RNA的條帶和測(cè)定A260/A280，檢測(cè)RNA質(zhì)量，計(jì)算RNA濃度。

1．6．3 cDNA 合成 取 RNA 1．5 μg，加 oligo(dT)18(500 ng/μl)1 μl，10 mmol/L dNTP Mix 1 μl，加水補(bǔ)充至總體積13 μl，65℃水浴5分鐘后，冰上放置至少1分鐘。短暫離心后，在離心管中依次加入5×First-Strand Buffer 4 μl，0．1 mol/L DTT 1 μl，RNase Inhibitor 1 μl和 SuperScriptⅢ RT 1 μl，混合均勻。50℃溫育60分鐘，70℃ 溫育15分鐘使酶失活。加91 μl滅菌水混勻，置冰浴待用。

1．6．4 PCR反應(yīng) 96孔板中的小鼠 Signal Transduction PathwayFinder PCR Array含有89個(gè)相關(guān)基因(包括 GUSB、HPRT1、HSP90AB1、GAPDH 和 β-Actin 5 個(gè)管家基因)。取 102 μl cDNA 加 550 μl 2×SuperArray PCR master mix和 448 μl雙蒸水混合，取10 μl置各孔中。將PCR Array置于實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)，設(shè)置程序?yàn)?聚合酶激活/變性(95℃)10分鐘，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)(95℃，15秒;60℃，1分鐘)，收集熒光。

1．6．5 采用 ΔΔCt方法分析數(shù)據(jù) 按公式:ΔCt(group 1)=average Ct-average of HK genes'Ct for group 1 array，計(jì)算每個(gè)處理組中的每個(gè)通路相關(guān)基因的ΔCt;按公式:ΔΔCt=ΔCt(組2)-ΔCt(組1)，計(jì)算2 個(gè) PCR Array(或兩組)中每個(gè)基因的 ΔΔCt;通過(guò)2-ΔΔCt計(jì)算組2 與組1對(duì)應(yīng)基因的表達(dá)差異。

2 結(jié)果

2．1 CD3/CD28誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖和活化 CD28共刺激能明顯加強(qiáng)CD3誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖，CD3e 5 μg/ml和CD28 1 μg/ml的濃度已能有效地誘導(dǎo)T細(xì)胞在48小時(shí)內(nèi)持續(xù)增殖(圖1)，激活T細(xì)胞，使IL-2的分泌量在24小時(shí)內(nèi)迅速上升(圖2)。因此選擇該抗體濃度用于后續(xù)研究。

圖1 不同濃度的CD3/CD28誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖(n=4)Fig．1 T cells proliferation induced by CD3/CD28 crosslinking with different concentrations(n=4)

2．2 CD3/CD28誘導(dǎo)T細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的基因mRNA變化 89個(gè)基因中，4個(gè)基因(Birc1a、Fgf4、Mmp7和Ptgs2)在CD3/CD28誘導(dǎo)的T細(xì)胞和未經(jīng)誘導(dǎo)的T細(xì)胞中都沒(méi)有表達(dá)(循環(huán)數(shù)＞35);1個(gè)基因(Bmp2)在CD3/CD28誘導(dǎo)的T細(xì)胞中沒(méi)有表達(dá);1個(gè)基因(Ccl2)在未經(jīng)誘導(dǎo)的T細(xì)胞中沒(méi)有表達(dá)。因?yàn)闊嵝菘说鞍自赥細(xì)胞激活后會(huì)發(fā)生改變［5］，因此HSP90AB1未作為管家基因計(jì)算。倍數(shù)(Fold change)相差2倍認(rèn)為表達(dá)有差異［6］。結(jié)果如表1和圖3所示，CD3/CD28共調(diào)節(jié)了43個(gè)基因，占檢測(cè)基因的51%，其中上調(diào)24個(gè)，下調(diào)19個(gè)，涵蓋檢測(cè)的所有18條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

圖2 CD3/CD28誘導(dǎo)T細(xì)胞IL-2分泌(n=3)Fig．2 CD3/CD28 cross-linking induced IL-2 production in T cells(n=3)

圖3 CD3/CD28誘導(dǎo)T細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路基因mRNA變化的散點(diǎn)分布圖Fig．3 Scatter plots for modulated genes in CD3 and CD28 cross-linking induced T cells

表1 CD3/CD28誘導(dǎo)T細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的基因mRNA變化Tab．1 Signal transduction genes mRNA found to be upregulated or downregulated in CD3 and CD28 cross-linking stimulated T cells based on PCR array

(續(xù)表1)

(續(xù)表1)

3 討論

T細(xì)胞在細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)中處于最為關(guān)鍵的位置，其激活受多重信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程的嚴(yán)格調(diào)控。共刺激信號(hào)先激活Lck、Fyn等 Src家族酪氨酸激酶(Src-related PTKs)，接著PTKs誘導(dǎo)跨膜蛋白或銜接蛋白LAT、TRIM、SLP76酪氨酸磷酸化，啟動(dòng)下游一系列信號(hào)傳遞。Ca2+、PKC、PI-3K/AKT、Ras、MAP/ERK、NFAT、NF-κB等通路被認(rèn)為是 T細(xì)胞主要的轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)［2］。結(jié)果顯示(表1)，T細(xì)胞經(jīng)CD3/CD28共刺激后，鈣與蛋白激酶C信號(hào)通路(Calcium and protein kinase C pathway)87．5%的基因發(fā)生改變;含Ras/MEK/Erk的促有絲分裂通路(Mitogenic pathway)及PI-3K/AKT通路均有50%的基因發(fā)生改變;NFAT和NF-κB通路均有66．7%的基因發(fā)生改變。除此之外，其他如 Wnt、Hedgehog、Jak-Stat、Phospholipase C、CREB等信號(hào)通路也有較多的基因都發(fā)生了改變。另外，如Fos、Ccnd1、Cdkn1a等基因參與多個(gè)信號(hào)通路的傳遞。以上結(jié)果表明，相互聯(lián)系的復(fù)雜的多重信號(hào)通路參與了T細(xì)胞的激活過(guò)程。

運(yùn)用cDNA全基因芯片，Teague等［7］報(bào)道了小鼠T細(xì)胞體內(nèi)經(jīng)超抗原刺激8和48小時(shí)后的基因變化情況;Diehn等［8］研究了人外周血T細(xì)胞體外激活過(guò)程中基因1小時(shí)至48小時(shí)的動(dòng)態(tài)變化;Shu等［5］也對(duì)小鼠T細(xì)胞經(jīng)體外刺激18和48小時(shí)的基因變化做了觀察。但這些研究都未對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中基因的變化情況作專門的描述。另外，全基因芯片包含許多與研究對(duì)象無(wú)關(guān)的基因，其提供的數(shù)據(jù)會(huì)對(duì)分析與研究對(duì)象有關(guān)的基因產(chǎn)生干擾，提供無(wú)用(Inconsequential)或錯(cuò)誤(Detrimental)的信息，而功能分類基因芯片(Real-time PCR芯片)可以剔除基因芯片上對(duì)研究對(duì)象無(wú)意義的基因，同時(shí)準(zhǔn)確檢測(cè)上百個(gè)基因的mRNA水平［9，10］。本文首次采用功能分類基因芯片——“信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)現(xiàn)者”PCR芯片研究了T細(xì)胞激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的基因變化情況，該結(jié)果有助于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)T細(xì)胞的激活過(guò)程，控制和預(yù)防T細(xì)胞相關(guān)的免疫性疾病。

致謝:感謝上?？党缮锕こ逃邢薰驹赑CR array檢測(cè)中提供技術(shù)支持!

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