趙 航 王 敏 曲麗瑩 劉春春 蔡 睿 于海洋 安 林 薛曉飛 劉 玲

(吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，吉林 長春 130021)

近年，腦缺血再灌注損傷成為醫(yī)學(xué)界研究的熱點問題。研究顯示，在腦缺血再灌注損傷的病理變化過程中細(xì)胞凋亡是主動的可逆的過程〔1〕。因此，對腦缺血再灌注損傷引起的神經(jīng)細(xì)胞凋亡機制進(jìn)行深入研究具有重要意義。細(xì)胞凋亡過程受多種基因的調(diào)控，Bcl-2、Bax、Caspase-3是凋亡信號傳導(dǎo)途徑中重要的調(diào)控基因。本實驗通過建立大鼠腦缺血再灌注模型，觀察腦缺血再灌注后Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)與再灌注時間的關(guān)系，初步探討了腦缺血再灌注過程中的神經(jīng)保護(hù)機制。

1 材料與方法

1.1 材料 氯化三苯基四氮唑(TTC)購自北京鼎國生物;RTPCR檢測試劑盒購自 TaKaRa公司;Bcl-2、Bax、Caspase-3抗體均購自Santa Cruz公司;免疫組織化學(xué)檢測試劑盒購自北京中衫生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物及分組 選擇健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠57只，重量250～280 g，由吉林大學(xué)動物實驗中心提供。飼養(yǎng)環(huán)境溫度18℃ ～22℃，光暗周期12 h。隨機分為:假手術(shù)對照組(12 只)和缺血再灌注2、6、12、24、48 h 組(每組 9 只)。缺血再灌注組制備大腦中動脈閉塞(MCAO)模型，假手術(shù)組的手術(shù)過程與缺血再灌注組一致，但只暴露頸總動脈，并不進(jìn)行插線。

1.2.2 MCAO大鼠模型的制備 應(yīng)用Zea-Longa線栓法:經(jīng)左側(cè)頸外動脈-頸內(nèi)動脈插線建立MCAO 2 h再灌注動物模型。實驗進(jìn)程中個別死亡的、蛛網(wǎng)膜下腔出血的大鼠剔除在外，確保每組完成實驗的動物達(dá)到7只。

1.2.3 TTC染色法 假手術(shù)組和模型組術(shù)后不同時間點各取1只大鼠，立即斷頭取腦，放在－20℃冰箱10 min待腦組織稍硬后，沿腦垂直軸做冠狀切片，片厚約2 mm，再置于2%的TTC溶液中，37℃避光孵育30 min。然后轉(zhuǎn)移至4%的多聚甲醛中固定。

1.2.4 RT-PCR檢測 Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA表達(dá) 按照TaKaRa提取試劑盒操作說明從冷凍的腦組織(每組3只)中提取總RNA，測定RNA濃度，取1 μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。RT-PCR特異引物由上海生工合成，引物序列見表1。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離，利用全自動數(shù)碼凝膠分析儀(Tanon 2500R)檢測目的cDNA。

表1 Bcl-2、Bax、Caspase-3、GAPDH 上下游引物序列

1.2.5 免疫組化檢測 Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表達(dá) 每組MCAO模型大鼠各3只，大鼠以37℃ 0.01 mol/L pH7.4磷酸鹽緩沖液(PBS)200 ml心臟灌流，4℃預(yù)冷4%多聚甲醛內(nèi)固定后，迅速分離大腦，置4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋并切片(5 μm)。常規(guī)脫蠟，按試劑盒說明書操作，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素輕度復(fù)染，脫水，透明，封片。

2 結(jié)果

2.1 TTC染色 TTC染色結(jié)果顯示腦缺血再灌注側(cè)腦組織有梗死灶，白色為梗死區(qū)，主要位于大腦皮質(zhì)、基底節(jié)區(qū)。見圖1。

2.2 RT-PCR 假手術(shù)組 Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA僅有微量表達(dá)，與其相比，Bcl-2 mRNA在缺血再灌注2 h后表達(dá)開始增多，6 h明顯增多，24 h達(dá)高峰，48 h開始減少;Bax mRNA表達(dá)較Bcl-2延后，2 h開始微量表達(dá)，6 h開始增多，增高趨勢持續(xù)至48 h;Caspase-3 mRNA從6 h后表達(dá)微量增多，12 h略有增多，24 h明顯增多，持續(xù)增高至48 h。見圖2。

2.3 免疫組織化學(xué)染色 假手術(shù)組Bcl-2、Bax、Caspase-3陽性細(xì)胞表達(dá)少，與其相比，Bcl-2表達(dá)的陽性細(xì)胞數(shù)在缺血再灌注后2 h開始增多，6 h陽性細(xì)胞數(shù)顯著增多，24 h陽性細(xì)胞數(shù)增多最為明顯，48 h未見減少;Bax表達(dá)的陽性細(xì)胞數(shù)在缺血再灌注后2 h微量增多，6 h開始明顯增多，增高趨勢至48 h;Caspase-3陽性細(xì)胞數(shù)在缺血再灌注后6 h微量表達(dá)12 h逐漸增多，24 h增加明顯，持續(xù)增多至48 h。見圖3。

圖1 TTC染色，白色區(qū)域為梗死區(qū)

圖2 Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA 在缺血再灌注后 2、6、12、24、48 h 的表達(dá)

3 討論

細(xì)胞凋亡過程受多種基因的調(diào)控，Bcl-2、Bax、Caspase-3被認(rèn)為是凋亡信號傳導(dǎo)途徑中重要的調(diào)控基因〔1，2〕。研究證實細(xì)胞凋亡有兩條途徑，分別為細(xì)胞表面死亡受體途徑和線粒體途徑〔3〕。Bcl-2家族參與線粒體途徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。Bcl-2和Bax是一對相互拮抗的凋亡相關(guān)因子，他們通過在線粒體外膜形成離子通道，阻止或促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放〔4，5〕。細(xì)胞色素C自線粒體釋放入胞質(zhì)，與凋亡蛋白活化因子-1(Apaf-1)、Caspase-9酶原結(jié)合，形成凋亡體。Caspase-9繼而激活下游的Caspase-3。Caspase-3主要參與細(xì)胞表面死亡受體途徑介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，是細(xì)胞凋亡下游通路的關(guān)鍵執(zhí)行者，Caspase-3的激活可以引起一系列酶促級聯(lián)反應(yīng)，通過破壞核骨架及細(xì)胞骨架導(dǎo)致細(xì)胞凋亡〔2～7〕。由此可見，Bcl-2家族蛋白是聯(lián)系細(xì)胞外凋亡途徑和細(xì)胞內(nèi)凋亡途徑的重要紐帶。Bcl-2和Bax通過表達(dá)的變化調(diào)控細(xì)胞色素C的釋放，進(jìn)而影響Caspase-3的激活。本研究發(fā)現(xiàn)大鼠局灶腦缺血再灌注損傷的12 h內(nèi)，Bcl-2和Bax表達(dá)有逐漸增高的趨勢，且Bcl-2的表達(dá)早于Bax，證明了Bcl-2蛋白的表達(dá)對神經(jīng)細(xì)胞具有保護(hù)作用，并且這種保護(hù)通路在損傷早期就已經(jīng)啟動。本實驗結(jié)果表明，在腦缺血再灌注的不同時間，Bax生成的上調(diào)與Caspase-3的激活密切相關(guān)。

總之，本研究結(jié)果提示在腦缺血再灌注的早期調(diào)控并促進(jìn)Bcl-2的表達(dá)，減少Bax和Caspase-3的表達(dá)將會對降低缺血再灌注過程中神經(jīng)細(xì)胞的損傷發(fā)揮重要作用。

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