楊 電，劉 超，徐曲毅，張 翼

（廣州市刑事科學(xué)技術(shù)研究所，廣東 廣州510030）

茚三酮薰顯法在人體接觸細(xì)胞發(fā)現(xiàn)采集中的應(yīng)用

楊 電，劉 超，徐曲毅，張 翼

（廣州市刑事科學(xué)技術(shù)研究所，廣東 廣州510030）

目的 研究茚三酮薰顯法在人體接觸細(xì)胞發(fā)現(xiàn)采集中的應(yīng)用價(jià)值。方法 對(duì)衣服、口罩、棍棒等可疑人體接觸細(xì)胞檢材258份，采用1%茚三酮溶液進(jìn)行顯色反應(yīng)，然后用磁珠法提取DNA，并進(jìn)行DNA定量和STR檢測(cè)。結(jié)果 可疑人體接觸細(xì)胞檢材中有172份顯色反應(yīng)陽(yáng)性，其中115份檢出的DNA濃度在0.02ng/μL以上并檢出6個(gè)以上STR基因座的基因型，檢出率為66.86%；顯色反應(yīng)陰性的86份檢材均未檢出DNA濃度或成功進(jìn)行STR基因型。結(jié)論 茚三酮薰顯技術(shù)可用于指導(dǎo)案件人體接觸細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)采集。

法醫(yī)遺傳學(xué)；人體接觸細(xì)胞；茚三酮顯現(xiàn)技術(shù)；STR分型

Abstract：ObjectiveTo evaluate the applicability of the ninhydrin-dyed method in the detection of human epithelial cells.Method 258 samples of clothes，masks and staves which might bear epithelial cells，were dyed with 1%ninhydrin，and DNA specimens were extracted by the magnetic beads method.Then DNA quantification and STR genotyping were performed to the collected samples.Results172 samples showed positive result，of which 115 had DNA concentrations above 0.02ng/μL and no less than 6 STR loci，with a detection rate of 66.86%.86 samples showed negative result，of which neither DNA nor STR loci could be detected.ConclusionNinhydrin-dyed method can be applied in the detection of human epithelial cells.

Key words：forensic genetics；epithelial cell；ninhydrin-dyed method；STR genotype

隨著DNA檢驗(yàn)在案件偵破中發(fā)揮的作用越來(lái)越強(qiáng)，近年來(lái)人體接觸細(xì)胞檢材的數(shù)量直線上升。人體接觸細(xì)胞檢材與常見(jiàn)生物檢材如血痕、精斑相比，肉眼觀察很難判斷是否存在人體接觸細(xì)胞及其在載體上的具體部位、數(shù)量的多少。因此迫切需要一種可指示人體接觸細(xì)胞存在的簡(jiǎn)便有效方法以幫助法醫(yī)工作者有效地對(duì)人體接觸細(xì)胞進(jìn)行提取、富集，提高DNA檢驗(yàn)的成功率。2004年，M.M.Schulz等[1]人曾報(bào)道在1宗兇殺案中利用茚三酮顯現(xiàn)潛在手印的方法作為發(fā)現(xiàn)人體接觸細(xì)胞的預(yù)試驗(yàn)取得了良好效果。但目前國(guó)內(nèi)只是對(duì)顯現(xiàn)的指印進(jìn)行DNA檢驗(yàn)進(jìn)行了較多的研究[2-3]，對(duì)手印顯現(xiàn)方法用于尋找人體接觸細(xì)胞的預(yù)試驗(yàn)方法的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本文采用1%茚三酮溶液薰顯案件提取的可疑人體接觸細(xì)胞檢材，提取DNA同時(shí)進(jìn)行DNA定量和STR分型。結(jié)果表明，茚三酮薰顯技術(shù)在指示人體接觸細(xì)胞存在方面具有簡(jiǎn)便快捷直觀、不影響DNA檢驗(yàn)的優(yōu)越性，可用于指導(dǎo)案件人體接觸細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)采集。報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 材料

衣服、褲子、口罩、帽子、棍棒、紙張、枕套、手套、電線、螺絲批、飲料瓶口、杯口、各種擦拭物等可疑人體接觸細(xì)胞檢材258份，均為2010年以來(lái)廣州市刑事科學(xué)技術(shù)所實(shí)際案件檢材。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 茚三酮熏顯

配制1%茚三酮乙醇溶液于噴罐中。對(duì)紙張、手套、口罩等淺色滲透性載體采用茚三酮溶液均勻噴霧后置溫度70℃的茚三酮熏顯柜中處理10min[4]。對(duì)頭套、深色手套等深色載體采用生物脫落細(xì)胞提取儀（公安部物證鑒定中心）吸取或脫落細(xì)胞粘取器（公安部物證鑒定中心）粘取，電線、螺絲批等非滲透性載體上可能存在人體接觸細(xì)胞的部位采用脫落細(xì)胞粘取器粘取或棉簽擦??；將吸附后的濾膜、粘附的膠帶紙或擦拭物置離心管中滴加茚三酮溶液濕潤(rùn)后70℃保溫5min。對(duì)棍棒等無(wú)法置熏顯柜中熏顯的大件物品用茚三酮溶液噴霧后置室溫6h以上[5]。檢材熏顯時(shí)均同時(shí)設(shè)已知陽(yáng)性和陰性對(duì)照。

1.2.2 DNA提取

對(duì)可疑接觸檢材中茚三酮顯色陽(yáng)性者提取陽(yáng)性部位，陰性者按經(jīng)驗(yàn)提取檢材，然后按文獻(xiàn)[5]在Maxwell（美國(guó)Promega公司）16自動(dòng)儀上提取DNA，洗脫體積均為 30μL。

1.2.3 DNA定量

按Quantifiler法醫(yī)人類DNA定量試劑盒（購(gòu)自美國(guó)AB公司）使用手冊(cè)在ABI 7500型熒光定量PCR儀上進(jìn)行定量PCR反應(yīng)。

1.2.4 STR復(fù)合擴(kuò)增和檢測(cè)分型

用SinofilerTM Kit（美國(guó)AB公司）進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為10μL，模板量為4μL。在3130xL遺傳分析儀（美國(guó)AB公司）上進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測(cè)分型。

《法庭科學(xué)DNA數(shù)據(jù)庫(kù)建設(shè)規(guī)范》中規(guī)定，D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、D13S317、D16 S539、D18S51、D21S11、CSF1PO、TPOX、TH01、VWA、FGA 等 13個(gè)核心基因座和Amelogenin基因座中須有任意6個(gè)以上的基因座檢測(cè)成功，方能將DNA分型數(shù)據(jù)及信息代碼輸入省級(jí)DNA數(shù)據(jù)庫(kù)和市級(jí)DNA數(shù)據(jù)庫(kù)。借鑒此標(biāo)準(zhǔn)，本研究將檢出6個(gè)以上數(shù)量的基因座（RFU≥50）認(rèn)為檢出，反之則為未檢出。

2 結(jié)果

2.1 茚三酮熏顯反應(yīng)

圖1為部分可疑人體接觸細(xì)胞檢材茚三酮熏顯后的照片。258份可疑人體接觸細(xì)胞檢材，有172份顯呈藍(lán)紫色陽(yáng)性反應(yīng)，其中一件確定放置6個(gè)月以上的穿過(guò)的衣服和一把放置3個(gè)月以上的用過(guò)的牙刷也顯示出陽(yáng)性反應(yīng)。另外86份可疑人體接觸細(xì)胞檢材未呈現(xiàn)顏色反應(yīng)。

2.2 DNA定量及STR檢驗(yàn)結(jié)果

172份茚三酮反應(yīng)陽(yáng)性的樣品中有115份檢出的DNA濃度在0.020ng/μL以上并檢出6個(gè)以上基因座的基因型，檢出率為66.86%；另57份樣品檢出DNA濃度在0.02ng/μL以下，且在空白對(duì)照正確的情形下，檢出的基因座數(shù)均小于2個(gè)，因此視為未檢出。茚三酮反應(yīng)陰性的86份樣品無(wú)一例測(cè)出DNA濃度，STR分型結(jié)果也與空白對(duì)照一致（見(jiàn)表1）。

表1 258份檢材經(jīng)茚三酮熏顯后提取DNA的STR檢驗(yàn)結(jié)果

圖1 部分可疑人體接觸細(xì)胞檢材茚三酮熏顯后的照片

2.3 案例應(yīng)用

2011年某月某日，廣州市公安局禁毒支隊(duì)破獲一宗制販毒案，在某農(nóng)場(chǎng)內(nèi)搗毀一個(gè)制毒工廠，繳獲制毒工具一批。為確定進(jìn)出制毒工廠的嫌疑人，提取了工廠內(nèi)發(fā)現(xiàn)的7根吸管、6個(gè)一次性塑料杯、5枚煙頭和6把牙刷要求進(jìn)行DNA檢驗(yàn)。對(duì)上述檢材采用茚三酮進(jìn)行顯色反應(yīng)，7根吸管、3個(gè)一次性塑料杯、2枚煙頭和2把牙刷呈現(xiàn)蘭紫色陽(yáng)性反應(yīng)，3個(gè)一次性塑料杯、3枚煙頭和4把牙刷顯色反應(yīng)陰性。對(duì)所有檢材采用磁珠法提取DNA后進(jìn)行DNA定量和STR反應(yīng)，顯色反應(yīng)陽(yáng)性的5根吸管、2個(gè)塑料杯、2枚煙頭和2把牙刷檢出的DNA濃度≥0.10ng/μL，并成功檢出共6名男性個(gè)體的15個(gè)STR基因座基因型，顯色反應(yīng)陽(yáng)性的2根吸管、1個(gè)塑料杯未檢出DNA濃度和STR基因型。顯色反應(yīng)陰性的3個(gè)塑料杯、3枚煙頭和4把牙刷均未檢出DNA濃度和STR基因型。

3 討論

人體接觸細(xì)胞的DNA檢驗(yàn)是法醫(yī)DNA檢驗(yàn)的熱點(diǎn)和難點(diǎn)之一。隨著DNA檢驗(yàn)靈敏度的提高，特別是近年來(lái)MiniSTR、單細(xì)胞DNA檢驗(yàn)和1μl體系擴(kuò)增等新技術(shù)的出現(xiàn)，使DNA含量少于100pg的LCN樣品也能夠有效分型，甚至只含有單個(gè)細(xì)胞的微量生物檢材也有成功分型的報(bào)道。但是，目前對(duì)人體接觸細(xì)胞檢材的檢驗(yàn)成功率并不高，許多檢材如刀柄、棍棒、繩索、指印上的人體接觸細(xì)胞檢驗(yàn)成功率不到30%。這主要原因在于肉眼觀察難以判斷人體接觸細(xì)胞的有無(wú)及在載體上的具體部位、數(shù)量的多少。顯微鏡檢查是確證人體接觸細(xì)胞存在的金標(biāo)準(zhǔn)，但不能對(duì)載體上的人體接觸細(xì)胞直接檢查，將載體上的人體接觸細(xì)胞轉(zhuǎn)移下來(lái)涂片檢查操作繁瑣，操作過(guò)程中可能造成污染和細(xì)胞損失，因此實(shí)際檢案中很少采用顯微鏡對(duì)人體接觸細(xì)胞進(jìn)行檢查。國(guó)外有研究采用熒光光譜和拉曼光譜分析技術(shù)對(duì)精液、汗液、唾液、尿液等體液斑進(jìn)行無(wú)損性的預(yù)試驗(yàn)檢測(cè)，但設(shè)備要求高，且只是處于研究階段[6]。而隨著證據(jù)意識(shí)的增強(qiáng)，辦案部門為了不放過(guò)任何一個(gè)可能留下嫌疑人信息的證據(jù)，對(duì)嫌疑人可能觸碰過(guò)的地方、物品凡是顯現(xiàn)不了指紋或指紋顯現(xiàn)不清的通通提取送檢DNA。1宗兇殺案往往提取幾十份甚至上百份檢材，其中大約一半為懷疑人體接觸細(xì)胞檢材。DNA檢驗(yàn)工作者為了證實(shí)送檢的物品上是否存在人體接觸細(xì)胞，往往要反復(fù)多次地進(jìn)行DNA提取、STR擴(kuò)增和檢測(cè)的操作，浪費(fèi)大量的人力、物力和時(shí)間。因此迫切需要一種可提示人體接觸細(xì)胞的存在及數(shù)量的多少的簡(jiǎn)便有效方法以幫助法醫(yī)工作者提高接觸DNA檢驗(yàn)的效率。

在手印顯現(xiàn)方法中，有些是利用化學(xué)試劑與指印中的氨基酸或蛋白質(zhì)進(jìn)行顯色反應(yīng)或熒光反應(yīng)[4]?，F(xiàn)有研究均顯示這些手印顯現(xiàn)方法不影響DNA檢驗(yàn)[1-3]。人體接觸細(xì)胞的形成原理與手印形成的原理一樣都是基于接觸-交換理論，由人體的皮膚粘膜與客體接觸后形成，人體接觸細(xì)胞中肯定含有氨基酸，因此采用針對(duì)氨基酸反應(yīng)的潛在手印顯現(xiàn)方法作為指示人體接觸細(xì)胞存在的預(yù)試驗(yàn)方法完全可行。

利用茚三酮與指印中的氨基酸或蛋白質(zhì)進(jìn)行藍(lán)紫色反應(yīng)，是淺色滲透性載體上潛在指印顯現(xiàn)的經(jīng)典方法。茚三酮薰顯方法操作簡(jiǎn)單快速、顯色反應(yīng)靈敏，不需要任何特殊設(shè)備，只需要普通的加熱裝置，甚至在室溫下也能完成薰顯，而且顏色鮮艷不褪色。本研究采用茚三酮薰顯方法對(duì)案件提取的258份可疑皮膚脫落細(xì)胞或口腔脫落細(xì)胞檢材進(jìn)行薰顯反應(yīng)，檢材上與人體接觸過(guò)的部位均呈藍(lán)紫色反應(yīng)。在同一載體上，顏色反應(yīng)的深淺程度與人體接觸程度正相關(guān)，與人體接觸的時(shí)間越長(zhǎng)、接觸得越緊密，顏色反應(yīng)越明顯。未與人體接觸的部位無(wú)顏色反應(yīng)。172份陽(yáng)性反應(yīng)的樣品中有115份檢出6個(gè)以上基因座的基因型，檢出率為66.86%，而顯色反應(yīng)陰性的86份檢材均未檢出STR基因型?？梢?jiàn)，茚三酮薰顯方法可用于指導(dǎo)人體接觸細(xì)胞檢材的發(fā)現(xiàn)采集。

在利用茚三酮對(duì)人體接觸細(xì)胞檢材進(jìn)行薰顯的過(guò)程中，本研究發(fā)現(xiàn)對(duì)于非滲透性載體、深色載體上可疑人體接觸細(xì)胞檢材，茚三酮難以直接薰顯，只能將其轉(zhuǎn)移到濾膜、膠帶紙或棉簽上再進(jìn)行顯色反應(yīng)，不能直接反映人體接觸細(xì)胞在這類載體上的原始分布情況。如何借鑒潛在指紋的其它顯現(xiàn)方法以指導(dǎo)非滲透性載體、深色載體上人體接觸細(xì)胞檢材的發(fā)現(xiàn)和采集，有待下一步研究。

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（本文編輯：李成濤）

Application of the Ninhydrin-dyed Method in the Detection of Human Epithelial Cells

YANG Dian，LIU Chao，XU Qu-yi，ZHANG Yi
（Guangzhou Criminal Science&Technology Institute，Guangzhou 510030，China）

DF795.4

A

10.3969/j.issn.1671-2072.2012.05.016

1671-2072-（2012）05-0105-03

2012-02-17

公安部應(yīng)用創(chuàng)新計(jì)劃資助項(xiàng)目（2005YYCX57136）；廣東省法醫(yī)遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)項(xiàng)目（2010A060801001）

楊電（1969—），女，主任法醫(yī)師，碩士，主要從事法醫(yī)DNA檢驗(yàn)與研究工作。E-mail：yangdianyy@163.com。