未分類黃病毒研究進展

郭金金 燕清麗 孫肖紅

(1.中國檢驗檢疫科學(xué)研究院 北京 100123;2.承德醫(yī)學(xué)院)

1 前言

黃病毒是一類重要的蟲媒病毒(arbovirus)。蟲媒病毒是指通過吸血的節(jié)肢動物叮咬敏感的脊椎動物而引起自然疫源性疾病和人獸共患病的一組病毒，除了黃病毒屬以外，還包括披膜病毒科甲病毒屬(29種)、呼腸孤病毒科(77種)和布尼亞病毒科(350種)［1］。目前已知黃病毒屬包括近70個具有抗原交叉反應(yīng)的病毒，與人類疾病相關(guān)的約有

40 多種［2］，如黃熱病毒(yellow fever virus，YFV)、登革病毒(dengue virus，DENV)、乙型腦炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)、西尼羅 病 毒(West Nile Virus，WNV)等。人、畜被攜帶病毒的節(jié)肢動物叮咬而感染，不但造成人類疾病和死亡，更會造成大批牲畜發(fā)病甚至死亡，造成巨大經(jīng)濟損失，成為各國的公共衛(wèi)生問題［3，4］。

目前，一類只感染昆蟲細(xì)胞(insect－only)的新型黃病毒被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)，這種病毒只能在昆蟲細(xì)胞系中增殖并引起細(xì)胞病變，卻不引起哺乳動物細(xì)胞系的細(xì)胞病變。細(xì)胞融合因子病毒(Cell fusing agent virus，CFAV)、卡密提河病毒(Kamiti River virus，KRV)和庫蚊黃病毒(Culex flavivirus，CxFV)都屬于這類黃病毒。國際病毒分類委員會將這類病毒定為“未分類黃病毒(non－classified flaviviruses，NCFV)”

2 未分類黃病毒的發(fā)現(xiàn)

第一種被發(fā)現(xiàn)的未分類黃病毒是 CFAV，于1975年在埃及伊蚊細(xì)胞系中分離出［5］;第二種是卡密提河病毒(Kamiti River virus，KRV)，于1999年在肯尼亞中部的蚊蟲體內(nèi)分離得到［6］;第三種是日本在2007年首次在庫蚊體內(nèi)分離到的庫蚊黃病毒(Culex flavivirus ，CxFV)［7］。2009 年在烏干達(dá)庫蚊體內(nèi)分離出的又一種新型未分類黃病毒Nakiwogo virus(NAKV)［8］。

2.1 CFAV 的發(fā)現(xiàn)

CFAV是第一個被發(fā)現(xiàn)的未分類黃病毒，1975年首次在埃及伊蚊細(xì)胞系的培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)，研究表明該病毒能引起白紋伊蚊細(xì)胞融合，因此將這種病毒命名為細(xì)胞融合因子病毒(Cell fusing agent virus)。CFAV不能在金黃地鼠腎(BHK)細(xì)胞、人口腔上皮樣癌(KB)細(xì)胞或非洲綠猴腎(Vero)細(xì)胞中進行復(fù)制，也不會導(dǎo)致BHK、KB或Vero細(xì)胞的融合。雖然CFAV的病毒結(jié)構(gòu)特征與黃病毒類似，但是與黃病毒屬其他成員間沒有血清學(xué)交叉反應(yīng)。此外，CFAV與黃病毒屬其他成員的不同之處還在于其不能在幾種脊椎動物的細(xì)胞如BHK、KB、Vero細(xì)胞內(nèi)進行復(fù)制［5］，所以當(dāng)時推測CFAV可能是類似B組披膜病毒科的病毒。直到1992年Cammisa－Parks等人確定CFAV的基因組核苷酸序列，通過將CFAV的核苷酸序列與GenBank中公布的核苷酸序列進行比較，發(fā)現(xiàn)CFAV與黃病毒屬其他成員相似性最高的是非結(jié)構(gòu)蛋白NS5基因(45%)和NS3基因(34%)，因此將CFAV歸類為黃病毒科黃病毒屬的新病毒種［9］，CFAV是當(dāng)時研究發(fā)現(xiàn)的唯一已知的未分類黃病毒［10］。

隨著研究的不斷深入，近年又在波多黎各的現(xiàn)場蚊蟲中分離到CFAV，這是第一次從野外蚊蟲標(biāo)本中分離到CFAV病毒［11］。在對波多黎各的蚊蟲研究中，CFAV除了在埃及伊蚊體內(nèi)分離到，還在白紋伊蚊及致倦庫蚊體內(nèi)分離到。研究發(fā)現(xiàn)蚊蟲的性別與CFAV檢出結(jié)果無明顯影響，由此可以推斷蚊蟲能否感染CFAV與是否吸血并無關(guān)聯(lián)。研究者用黃病毒屬通用引物(PF1–PF2–PF3)進行半巢式RT－PCR，擴增黃病毒屬NS5基因，用CFAV多個片段(NS1－NS5，E)及蚊蟲物種鑒定的COI、COII基因片段的引物對蚊蟲標(biāo)本進行擴增，結(jié)果顯示CFAV的相關(guān)基因序列已整合到伊蚊的基因組中，可能是因為蚊蟲感染CFAV組的病毒而導(dǎo)致基因的整合［11］。

2.2 KRV 的發(fā)現(xiàn)

未分類黃病毒家族的第二位成員KRV，首次分離于肯尼亞的新黑蚊亞屬的mcintoshi蚊蟲體內(nèi)。1999年在肯尼亞的低洼水坑采集蚊幼蟲，在實驗室飼養(yǎng)成成蚊，并進行病毒分離，在兩批mcintoshi蚊蟲標(biāo)本中分離出兩株只能在昆蟲細(xì)胞復(fù)制而不能在脊椎動物細(xì)胞或小鼠的細(xì)胞中復(fù)制的病毒株。用甲病毒屬、布尼亞病毒屬和黃病毒屬的引物進行RTPCR檢測，只有黃病毒引物擴增出目的片段，序列比對發(fā)現(xiàn)這兩株病毒和CFAV關(guān)系最為密切。另外，這兩株病毒和已知的蟲媒病毒之間沒有抗原交叉反應(yīng)，交叉中和試驗表明這兩株毒株為一種新的未分類黃病毒，因此就以當(dāng)?shù)氐孛芴岷?Kamiti river)命名為卡密提河病毒(Kamiti River virus)［12］。

2007年肯尼亞醫(yī)學(xué)研究中心的幾位學(xué)者發(fā)現(xiàn)，埃及伊蚊對KRV易感性極高，成年雌蚊和蚊幼蟲的感染率分別為62%和90.2%，被感染的蚊蟲還可通過垂直傳播傳染給下一代［13］。

2.3 CxFV 的發(fā)現(xiàn)

未分類黃病毒的第三個成員是CxFV，在庫蚊中分布廣泛，因此被命名為庫蚊黃病毒(Culex flavivirus)［7］。這種病毒和CFAV、KRV一樣，只能在昆蟲細(xì)胞中復(fù)制使其發(fā)生病變。進化分析顯示，CxFV與CFAV、KRV進化關(guān)系最近。CxFV的3'非編碼區(qū)包含四個串聯(lián)重復(fù)序列，其中有兩個重復(fù)序列與CFAV和KRV 3'非編碼區(qū)的相似。這些結(jié)果表明，CxFV可能是一種新的昆蟲黃病毒。

2009年在烏干達(dá)的蚊蟲中也分離到CxFV，這是首次非洲分離到CxFV。而在對烏干達(dá)的蚊蟲研究中Shelley Cook等人還在曼蚊種體內(nèi)發(fā)現(xiàn)一種新的未分類黃病毒，初步命名為Nakiwogo virus(NAKV)，這種病毒與CxFV的親緣關(guān)系最近［8］。

CxFV 還曾經(jīng)從危地馬拉和墨西哥［14，15］、美國得克薩斯州和特立尼達(dá)島的致倦庫蚊和Culex restuans庫蚊中分離到［16］。臺灣學(xué)者在蟲媒病毒調(diào)查中，從三帶喙庫蚊中也分離出5株CxFV［17］。我國遼寧省在2009年和2010年蟲媒病毒調(diào)查中從淡色庫蚊中分離到4株CxFV，從中華按蚊、三帶喙庫蚊中各分離到1 株 CxFV［18～23］。

3 未分類黃病毒的結(jié)構(gòu)

CFAV、KRV和CxFV跟其他黃病毒結(jié)構(gòu)類似，是一種直徑約為50nm的有包膜病毒，病毒基因組為單股正鏈RNA，全長約11kb?；蚪M包含一個開放閱讀框(open reading frame ，ORF)，自5'至3'端依次編碼結(jié)構(gòu)衣殼蛋白蛋白C、膜蛋白M、包膜蛋白E以及非結(jié)構(gòu)蛋白 NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5，病毒RNA在細(xì)胞漿內(nèi)直接起mRNA作用，翻譯出結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白，在胞漿粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)裝配成熟，出芽釋放。

CFAV、KRV和CxFV三種未分類黃病毒的基因組大小存在一些微小的差異，其中CFAV病毒基因組全長約10.6－10.7kb，盡管CFAV的氨基酸序列和其他黃病毒的氨基酸序列相差很多，但是CFAV的蛋白酶的理化特性跟其他黃病毒是一樣［11］。目前已公布全基因序列的未分類黃病毒共15株(表1)，其中CFAV 2株、KRV 1株、CxFV12株。唯一公布基因組全序列的 KRV基因組全長約為11.3 kb［6］，而CxFV除中國遼寧分離株基因組全長10.8 kb［18～23］，其余已公布序列的分離株基因組全長均為11.8 kb［7，15，16，24］。

表1 已公布全基因組序列的15株未分類黃病毒

目前研究較詳細(xì)的CFAV三個結(jié)構(gòu)蛋白中，E蛋白與其他黃病毒有很大不同。在對幾個黃病毒的抗原反應(yīng)時缺乏的血凝抑制活性，抗CFAV的血清與感染2型DENV，乙腦病毒或牛病毒性腹瀉病毒細(xì)胞不發(fā)生任何發(fā)生反應(yīng)［11］。

4 與其他黃病毒的關(guān)系

1999年國際病毒分類學(xué)委員會(The International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV)第七次會議上，黃病毒屬在生態(tài)學(xué)上被分為三組:蚊傳黃病毒(Mosquito borne flaviviruses，MBFV)、蜱傳黃病毒(Tick borne flaviviruses，TBFV)及無確定傳播媒介的黃病毒(No Known Vector flaviviruses，NKV)［25］。但是，這種分類方案不包括 CFAV、KRV及CxFV。目前這三種病毒已被列入黃病毒屬，冠名為未分類黃病毒(non－classified flaviviruses，NCFV)，這三種病毒并不屬于蟲媒病毒，而是感染昆蟲的病毒，只在蚊蟲體內(nèi)存在，在實驗室條件下它們只在蚊細(xì)胞系中復(fù)制［26］。

從黃病毒的遺傳發(fā)育看，NCFV與蚊傳黃病毒、蜱傳黃病毒關(guān)系較遠(yuǎn)，屬于其他黃病毒的遠(yuǎn)親［27，28］。將 CFAV、KRV、CxFV 和其他黃病毒的 E基因進行遺傳發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)(圖1)，CFAV、KRV、CxFV共同處于一個分支，其中CFAV、CxFV的遺傳關(guān)系更近，KRV則獨立于CFAV、CxFV，處于單獨一個分支［7］。而乙腦病毒(JEV)、登革 2型病毒(DEN2V)、橫瀨病毒(Yokose virus，YOKV)，以及蜱傳腦炎病毒(tick－borne encephalitis virus，TBEV)、阿波依病毒(Apoi virus，APOIV)則同處于另一個較遠(yuǎn)的分支中。2009年在對烏干達(dá)分離的昆蟲黃病毒研究中，對NS5基因和整個OFR進行序列比對，結(jié)果與E基因遺傳發(fā)育情況不同的是，CFAV與KRV 的關(guān)系更為密切［8］。

圖1 NCFV的E基因的遺傳發(fā)育樹

5 與疾病的關(guān)系

目前研究，未分類黃病毒被認(rèn)為是一種特殊的蚊蟲病毒，并不引起人類疾病，到目前為止還沒有在任何脊柱動物細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)這種病毒的感染。但是，一些學(xué)者強調(diào)，隨著生物進化，不排除這類病毒由蚊子傳播給人類或其他動物的可能性［29］。近年發(fā)現(xiàn)的新發(fā)蚊媒病毒，如版納病毒 (Banna virus，BAV)［30，31］和遼寧病毒 (Liaoning virus，LNV)［32，33］都與人類或動物疾病相關(guān)，因此未分類黃病毒對人類的潛在危害也不能忽視，未來這類病毒與人類疾病的關(guān)系將是今后研究的方向之一。

2007年Christophe N等發(fā)現(xiàn)CFAV絲氨酸蛋白酶的結(jié)構(gòu)類似于其他黃病毒的NS2B/NS3復(fù)合體，這種復(fù)合體能催化裂解病毒的一些多聚蛋白，可能是抗黃病毒藥物的作用靶位之一而受到廣泛關(guān)注［34］。

6 結(jié)論與展望

從1975年從細(xì)胞培養(yǎng)物中分離得到CAFV到1999年從野外蚊蟲標(biāo)本中分離到KRV，過去了20余年，而近五年內(nèi)就在野外蚊蟲體內(nèi)分離到兩種未分類黃病毒，分別是2007年在日本發(fā)現(xiàn)的CxFV和2009年在烏干達(dá)發(fā)現(xiàn)的NAKV。蚊蟲及蟲媒病毒調(diào)查范圍的擴大和實驗室檢測技術(shù)的提高是其主要原因之一。隨著我國蟲媒病毒研究的不斷深入，相信也有可能分離到更多這類病毒。

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