UPLC－MS/MS測定鮮切康乃馨和柃木中農(nóng)藥多殘留

陳先鋒 湛嘉 鐘鶯鶯 顧建鋒 俞雪鈞 彭錦峰 馮睿 王松青 崔俊霞

(寧波出入境檢驗檢疫局 浙江寧波 315012)

1 前言

我國是鮮活植物出口大國。據(jù)海關最新統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，2011年1至10月，我國花卉出口額已達1.57億美元，常見的品種包括菊花、康乃馨、百合、月季。此外，在日本用做敬祭祖先供品的鈴木、楊桐的鮮切葉出口已占有日本70%－80%的市場份額。然而，鮮活植物極易攜帶線蟲、昆蟲等病蟲害［1］，檢疫風險大，屬高風險出口產(chǎn)品，須經(jīng)過嚴格的除害處理，其中農(nóng)藥浸泡處理一直是最直接有效而且能保持產(chǎn)品外觀品質(zhì)的常用方法之一［1－3］。但農(nóng)藥的使用會帶來新的問題。雖然日本、歐美等發(fā)達國家也尚未對進口的鮮切花等鮮活植物產(chǎn)品提出明確的農(nóng)藥等有毒有害物質(zhì)的殘留限量要求，但隨著這些發(fā)達國家對農(nóng)藥等化工品的使用及控制要求的日益嚴格，以及民眾環(huán)保意識的提高，德國、日本等國家已經(jīng)開始關注鮮活植物等產(chǎn)品中農(nóng)藥使用及其殘留量。因此，我國鮮切花、鮮切葉、盆景等苗木等產(chǎn)品中的農(nóng)藥等殘留問題很有可能成為影響正常出口的潛在隱患，未來有可能成為技術壁壘。

然而，目前除了關于干菊花農(nóng)殘檢測方法的報道外［4］，關于鮮活植物中的農(nóng)藥殘留檢測方法報道幾乎一片空白。筆者對鮮活植物出口的周邊企業(yè)農(nóng)藥使用情況進行調(diào)查，并收集相關文獻［1－3］，總結出最典型或影響較大的25種常用農(nóng)藥(見表1)，作為代表進行方法學研究，囊括了低毒、中毒和高劇毒的常見農(nóng)藥品種(包含了極性和非極性)，旨在為今后出口鮮活植物產(chǎn)品的農(nóng)藥殘留控制及有效應對國外有可能成為的相關技術壁壘打下堅實基礎。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 儀器與試劑

超高效液相系統(tǒng)(ACQUITY UPLC)和三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜(XEVO TQ):Waters公司;PL2002型電子天平:梅特勒中國公司;冷凍離心機(3－15k):德國Sigma公司;超純水器:法國Milliporeco公司;Votexgenie－2型旋渦混合儀:美國Scientific Industries公司;多通道過濾裝置(Superb mutli－filter 20－40，用于固定多個過濾器):寧波賽恩斯公司。

標準品依次為:甲胺磷、多菌靈、殺蟲瞇、氧化樂果、敵敵畏、克百威、定蟲瞇、樂果、丙線磷、吡蟲啉、敵百蟲、甲拌磷、硫線磷、噻唑磷、對硫磷、雙甲脒、辛硫磷、苯線磷、除蟲脲、馬拉硫磷、氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯、阿維菌素、伊維菌素，均購自Dr.Ehrenstorfer，用乙腈 +二甲亞砜(V/V=9/1)配制1.0 mg/mL，然后各取1 mL，用乙腈定容于25 mL容量瓶中，即為40μg/mL。

D－SPE混合固相萃取填料:240 mg，包括PSA:C18:MgSO4混合比例為4:2:2。

2.1.2 試驗材料

康乃馨和柃木分別取自寧波花鳥市場和寧波東榮花藝，分別用塑料袋密封后，置于0℃冰箱中避光保存。

2.2 方法

2.2.1 提取

將鮮切康乃馨和柃木用剪刀剪碎后，用廚用粉碎機粉碎，稱取2.50g左右(精確到0.01g)粉碎后的樣品，加入乙腈30 mL，組織勻漿1 min，加入1 g MgSO4，超聲提取15 min，冷卻至4℃以4000 rpm離心10 min，取上清液于1.0 mL到15 mL離心管(a)中。

2.2.2 凈化

在離心管(a)中加入乙腈5 mL，加入240±10 mg混合固相萃取填料(2.1)，充分混勻后，以12000 rpm離心5 min。在離心管(a)取157μL于15 mL離心管(b)中，加42.8%甲醇溶液(含乙酸銨1.25 mmol/L)1.0 mL，充分混勻后，經(jīng)過針式過濾器(0.45μm孔徑，膜材料為特富龍)，進行 UPLCMS/MS測定。

2.2.3 色譜質(zhì)譜條件

色譜柱為Acquity Waters HSS－T3 C18(2.1 mm x 100 mm，1.8 μm);柱溫:40℃;流速:400 μL/min;選擇流動相A1:1.25 mmol/L乙酸銨水溶液，流動相B1:甲醇;梯度洗脫程序(以體積百分比記)為:0－6.8 min，100% －0%A1;6.8 －11.5 min，0%A1;11.5 －11.6 min，0 － 100%A1;11.6 －13 min，100%A1;各洗脫時間段中均以流動相B1補足余下的百分數(shù)。流路切換:0－1.4 min切換閥打開，色譜柱流出液進入廢液，1.4 min后開始質(zhì)譜采集。

正離子模式下通過多反應監(jiān)測(MRM)進行數(shù)據(jù)采集;毛細管電壓為3.5 kV;離子源溫度:150℃;去溶劑氣溫度:450℃;去溶劑流速:750 L/h;錐孔流速:50 L/h;碰撞氣體:氬氣3.3 ×10－3mba。

2.2.4 標準曲線定量

在2種粉碎好的空白鮮切植物樣品中，分別加入 0、2.5、12.5、25、50、75、100 μg，按上述前處理后進行測定，以其濃度為橫坐標，儀器響應值為縱坐標，分別做基質(zhì)添加標準曲線。

2.2.5 檢測限、回收率和精密度

在2.5 g粉碎好的空白鮮切樣品中，加0.25、0.5、1、2.5 μg 標準品，按上述前處理，以信號大于10倍基線噪音確定最低定量限。在2.5 g粉碎好的空白鮮切樣品中，加 2.5、12.5、25 μg標準品，按上述前處理后進行測定，每個水平重復6次，測定其回收率和精密度。

3 結果與討論

3.1 UPLC－MS－MS參數(shù)優(yōu)化

3.1.1 離子化的選擇

如圖1所示，25種化合物中，基本電離方式為［M+H］+，菊酯類和阿維菌素類等電離方式為［M+NH4］+。對于阿維菌素類，還存在［M+Na］+電離方式，響應值比［M+NH4］+相對更強。由于此時錐孔電壓很高，本底噪音較小，試驗發(fā)現(xiàn)，線性(R2在0.997 －0.999)也與［M+NH4］+的線性(R2在0.998－0.999)差異不大，故本實驗中采用母離子選擇［M+Na］+。然而David(2007)則認為阿維菌素類［M+Na］+響應的線性差，與本文的結論不相吻合［5］。25種農(nóng)藥的保留時間、質(zhì)譜參數(shù)和離子比例見表1。

圖1 25種農(nóng)藥LC－MS/MS譜圖

表1 25種農(nóng)藥的保留時間、錐孔電壓、定量離子對、定性離子對和離子比例

3.1.2 流動相的優(yōu)化

根據(jù)色譜保留行為和離子化效率來優(yōu)化流動相。0.1%甲酸水溶液－甲醇、不同濃度的乙酸銨水溶液(0.625、1.25、2.5、5、10 mmol/L) － 甲醇等 7種不同的流動相進行對比。在0.1%甲酸水溶液－甲醇體系中，菊酯類和阿維菌素類響應很低;不同乙酸銨濃度下，對于同一混標(20 ng/mL)，起初隨著乙酸銨濃度的增加，響應值略微增加，到2.5 mmol/L相應變化不明顯，之后隨著乙酸銨濃度增加，響應值普遍逐步降低。因此，1.25 mmol/L乙酸銨水溶液－甲醇為最佳流動相。乙腈與甲醇相比雖然可以降低系統(tǒng)壓力，但使用甲醇的靈敏度相對更高。

3.1.3 定容液的選擇

定容液的選擇至關重要，對回收率、色譜峰的形狀和離子化效率有較大影響［6］。一方面，定容液的有機溶劑含量過高，保留時間較短的水溶性強的化合物如甲胺磷和氧化樂果等的色譜峰會拓寬，甚至形成雙峰，影響靈敏度和線性;另一方面，當有機溶劑含量較低時(低于50%)，菊酯類和阿維菌素類等的回收率會顯著下降，這是因為這些物質(zhì)的溶劑度在有機相含量低的溶劑中大大降低，且容易在試管、濾器等地方被吸附。另外，定容液中含有乙酸銨可以促進［M+NH4］+電離方式的菊酯類化合物的離子化效率。因此，本方法選擇定容液(水:甲醇:乙腈 =4:3:1，含乙酸銨1.25 mmol/L)，有機相約在50%，甲胺磷和氧化樂果盡管會出現(xiàn)極性較弱的化合物雙峰現(xiàn)象，但線性仍然較好(R2＞0.990)，其他種類的色譜峰幾乎沒有受高含量有機溶劑影響。

3.2 方法學參數(shù)

3.2.1 特異性、標準曲線

未經(jīng)藥物處理的空白鮮切康乃馨和柃木各20份中均為檢出上述農(nóng)藥，表明該方法的特異性良好?？的塑爸?5種農(nóng)藥標準曲線線性相關系數(shù)R2的范圍均為 0.997－1.000，線性范圍在 0－75.4 ng/mL(樣品濃度范圍0－40 mg/kg)(見表2)，柃木中25種農(nóng)藥標準曲線線性相關系數(shù)R2的范圍為0.997－1.000，線性范圍在 0 －75.4 ng/mL(見表2)。超出線性的，用空白樣液進行稀釋。

表2 鮮切康乃馨和柃木中25種農(nóng)藥的標準曲線、回歸系數(shù)和線性范圍

3.2.2 檢測限、回收率和精密度

康乃馨平均添加回收率范圍84.7% －1 14.1%，RSD范圍2.2% －13.5%(見表3);柃木平均添加回收率范圍78.2% －115.8%，RSD 范圍1.1% －15.7%(見表4)。在兩種基質(zhì)中，超過90%的平均回收率在70% －110%范圍，回收滿意，80%以上RSD數(shù)據(jù)均不高于10%，精密度良好。

雖然基質(zhì)的復雜性不同，對定量檢測限差別不大，當添加水平為0.5 mg/kg時，所有農(nóng)藥離子對S/N均大于10。由于鮮切植物并非用來食用，建議將檢測限和最大殘留限量一律定在0.5 mg/kg。

表3 鮮切康乃馨中25種農(nóng)藥標準曲線和相關系數(shù)

表4 鮮切柃木中25種農(nóng)藥回收率、精密度

D i m e t h o a t e 8 8.8 ±8.8 1 0.0 1 0 2.7 ±8.7 8.5 8 9.4 ±5.4 6.0 E t h o p r o p h o s 9 7.8 ±1 2.9 1 3.2 1 0 0.1 ±4.8 4.8 8 5.4 ±4.7 5.5 I m i d a c l o p r i d 1 0 0.0 ±1 0.7 1 0.7 1 1 4.2 ±1 4.5 1 2.7 1 0 5.6 ±6.7 6.3 T r i c h l o r f o n 1 1 3.9 ±1 0.5 9.2 1 0 6.1 ±4.9 4.6 8 0.9 ±3.8 4.8 P h o r a t e 1 0 9.6 ±1 1.9 1 0.9 1 0 7.7 ±4.1 3.8 8 8.1 ±5.3 6.0 C a d u s a f o s 9 8.2 ±1 3.6 1 3.8 9 9.7 ±5.5 5.5 7 8.9 ±3.4 4.4 F o s t h i a z a t e 9 9.1 ±8.0 8.1 1 0 0.5 ±4.9 4.9 8 4.6 ±5.6 6.6 P a r a t h i o n 9 9.1 ±1 5.6 1 5.7 9 3.3 ±5.1 5.5 7 8.2 ±6.7 8.6 A m i t r a z 8 9.4 ±1 2.2 1 3.6 1 0 2.2 ±4.9 4.8 7 8.4 ±3.3 4.2 P h o x i m 1 0 0.4 ±1 1.2 1 1.1 1 0 0.9 ±3.8 3.8 8 3.4 ±3.6 4.4 F e n a m i p h o s 1 0 6.9 ±6.4 6.0 1 0 7.9 ±6.2 5.8 8 9.4 ±4.6 5.1 D i f l u b e n z u r o n 9 3.8 ±6.5 7.0 1 0 7.2 ±1.2 1.1 8 8.9 ±8.0 9.1 M a l a t h i o n 1 0 1.8 ±1 4.9 1 4.6 1 0 0.7 ±4.6 4.6 8 2.5 ±4.7 5.7 C y m p e r a t o r 1 0 7.4 ±1.7 1.5 9 8.8 ±1.5 1.5 8 6.4 ±5.1 5.9 F e n v a l e r a t e 1 1 0.0 ±2.2 2.0 1 0 4.4 ±5.2 5.0 8 7.8 ±2.2 2.6 D e l t a m e t h r i n 1 0 7.7 ±2.7 2.5 1 0 8.5 ±8.6 7.9 9 0.0 ±5.2 5.7 A b a m e c t i n B 1 a 1 0 7.5 ±8.3 7.7 1 0 3.5 ±1 0.3 9.9 9 1.9 ±3.6 4.0 I v e r m e c t i n 1 1 5.8 ±1 0.5 9.1 1 0 6.3 ±7.6 7.1 9 4.2±7.4 7.9

3.3 樣品的凈化

雖然25種待測物的極性范圍分布較廣，理化性質(zhì)差異大，為了保證都能獲得較好的回收率，提取和凈化必須具有一定的通用性［7］。

乙腈配合一些鹽類(NaCl、MgSO4、檸檬酸三鈉等)是國內(nèi)外農(nóng)藥多殘留分析中使用最流行的高效提取溶劑，同時共萃取的干擾物少，用水稀釋后可以直接進樣，可以加快前處理速度，優(yōu)于甲醇、丙酮和乙酸乙酯［8］。提取液中含有大量葉綠素等脂溶性強物質(zhì)，若不經(jīng)過凈化處理，菊酯類、阿維菌素類受到明顯的抑制效應，靈敏度相當?shù)?。為了克服LC－MS/MS的基質(zhì)效應問題，凈化處理是至關重要的［9］。從便利高效考慮，選擇已經(jīng)在蔬菜水果農(nóng)殘檢測廣泛使用的QuEChERS方法對乙腈提取液進行凈化處理，其核心步驟是基質(zhì)分散固相萃取(DSPE)，此方法既具有簡便性又具有通用性［9－10］。對填料 PSA，石墨化碳(GCB)、中性氧化鋁、C18、NH2進行篩選，發(fā)現(xiàn)PSA和C18不僅有較好的凈化作用，而且對回收率影響甚小，硫酸鎂用于吸收水分。C18對去油脂非常高效，PSA對有機酸、固醇類、糖類和脂類均有較好的吸附性，PSA比NH2吸附顏色更深，這是由于其含有兩個氨基，離子交換容量更大的原因［11］。石墨化碳具有最好的除色素作用，美中不足的是對雙甲脒吸附強，當每毫升乙腈中超過5 mg GCB時，甚至超過50%。這是由于雙甲脒分子為平面結構的芳香烴(見圖2)，極易被石墨化碳片狀所吸附。Stanislaw也曾指出當每毫升乙腈中超過10 mg GCB時，嘧菌環(huán)胺、喹螨醚、嘧霉胺、喹氧靈、五氯硝基苯等農(nóng)藥容易被GCB吸附［12］。中性氧化鋁在去除本底干擾物的同時，會吸附特定待測組分，引起回收率的降低。

圖2 雙甲脒結構式

最終選用在乙腈中加入PSA和C18填料除雜質(zhì)的方法，與固相萃取小柱相比節(jié)約成本和時間，而且具有更好的回收率和重復性［13］。

3.4 實際樣品分析結果

在除害處理車間取樣經(jīng)分析，分別檢出樂果的平均含量在6.79 mg/kg，柃木中氧化樂果平均含量為0.12 mg/kg，檢出氰戊菊酯為 4.15 mg/kg。另外，在寧波地區(qū)花店進行康乃馨抽樣檢測，檢出氧化樂果最高濃度為0.071 mg/kg、雙甲脒的最高濃度為0.087 mg/kg 和定蟲瞇最高濃度為0.79 mg/kg。

4 結論

鮮切植物是極為復雜的基質(zhì)，在本方法中樣品僅需乙腈提取和d－SPE(PSA和C18填料)凈化，對于不同理化性質(zhì)的受試農(nóng)藥，不僅基質(zhì)效應小，而且回收率理想、精密度良好;單個樣品前處理的時間少于 1h，儀器分析運行時間13min。表明了QuEChERS結合UPLC－MS/MS具有快速和通用特點，適合鮮切植物中多類別農(nóng)藥殘留檢測，具有顯著的省時、省力、低消耗的特點。

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