杠柳苷元抑制人乳腺癌細(xì)胞增殖作用的研究

李海霞 韓琛 李一光

杠柳是主產(chǎn)于中國(guó)遼寧、吉林、河北、山東、山西等省區(qū)的一種蘿藦科植物［1］，其干燥的根皮即稱為“香加皮”，含有甾醇、酯類等多種化合物［2］，具有祛風(fēng)濕、強(qiáng)筋骨、利尿、驅(qū)蟲、升壓等多種藥理功效［3］。

近年來(lái)，隨著中藥有效成分研究的進(jìn)展，對(duì)于傳統(tǒng)中藥香加皮研究發(fā)現(xiàn)了多種不同于傳統(tǒng)應(yīng)用的藥理學(xué)作用，例如抗炎作用［4］、強(qiáng)心作用［5］、抗癌作用［6］等，而其中杠柳苷元是香加皮產(chǎn)生抗炎作用的物質(zhì)基礎(chǔ)［4］，并在香加皮抗腫瘤的過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。為觀察杠柳苷元的體外抗乳腺癌細(xì)胞的作用，對(duì)其機(jī)制做較為深入的探討，特開展本實(shí)驗(yàn)，為客觀評(píng)價(jià)和進(jìn)一步開發(fā)研究其臨床應(yīng)用價(jià)值提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 杠柳苷元由中藥香加皮提取純化而得到，純度大于98%;MCF7由沈陽(yáng)藥科大學(xué)中日醫(yī)藥研究所惠贈(zèng);DMEM培養(yǎng)液購(gòu)自Hyclone公司(UT，USA);胎牛血清購(gòu)自TBD 公司(天津，中國(guó))，proCaspase-9、Caspase-9、Caspase-3 抗體及辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗購(gòu)自Santa Cruz公司(CA，USA)，MTT購(gòu)自Sigma公司(MO，USA)。其他試劑均為分析純。使用的儀器為二氧化碳培養(yǎng)箱(NuAir，USA)，DYYIII28A型蛋白電泳儀(北京，中國(guó))，酶聯(lián)免疫分析儀(Tecan，Austria)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法 ①M(fèi)TT法:取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF7細(xì)胞，以1×105cell/ml的密度接種于96孔板中，每孔100 μl，培養(yǎng)18 h后，加入含有杠柳苷元(0-160 μm)的培養(yǎng)液，于37℃，5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)18 h，在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)的變化后，每孔加入 MTT 15 μl(5 g/L)，DMSO150 μl溶解后，于酶標(biāo)儀492 nm處檢測(cè)，測(cè)定吸光值，并計(jì)算抑制率，繪制各點(diǎn)的抑制率反應(yīng)曲線。

抑制率(%)=［A492(control)-A492(periplogenin)］/［A492(control)-A492(blank)］×100%。②蛋白免疫印跡法:將MCF7細(xì)胞以5×105cell/ml的密度接種于培養(yǎng)瓶中，每瓶8 ml，培養(yǎng)18 h后，加入濃度為0和75 μm的杠柳苷元，作用6、12、18 h后，用0.05%的胰酶將MCF7細(xì)胞消化下來(lái)，終止消化并將細(xì)胞混懸液離心。加入細(xì)胞裂解液冰浴裂解30 min，12000r/min離心10 min后提取上清，測(cè)定蛋白濃度，以10%SDS-PAGE電泳分離蛋白，并將蛋白過(guò)夜轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，封閉后加入小鼠抗人Caspase-3、兔抗人Caspase-9以及兔抗人proCaspase-9孵育過(guò)夜，漂洗后加羊抗鼠或羊抗兔的二抗結(jié)合，漂洗后用TTBS洗膜，加入ECL顯影劑顯色后用膠片曝光，定影后得到上述蛋白的條帶。

2 結(jié)果

2.1 杠柳苷元對(duì)MCF7細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖的抑制作用。

如圖1所示，杠柳苷元以40 μm及以上的濃度作用于MCF7細(xì)胞18 h時(shí)，均具有明顯地抑制作用(P＜0.05)，且此抑制作用呈劑量依賴性。其半數(shù)抑制濃度為97 μm。

圖1 杠柳苷元對(duì)MCF7細(xì)胞的抑制作用

2.2 杠柳苷元對(duì)MCF7內(nèi)相關(guān)凋亡蛋白的影響。

如圖1所示，當(dāng)75 μM的杠柳苷元作用于MCF7時(shí)，能夠促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)凋亡蛋白casepase-3蛋白的表達(dá)以及proCaspase-9轉(zhuǎn)化為Caspase-9，且促凋亡蛋白Caspase-9、Caspase-3在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)呈時(shí)間依賴性地增加。

圖2 杠柳苷元對(duì)MCF7內(nèi)相關(guān)凋亡蛋白的影響

3 討論

目前普遍認(rèn)為惡性腫瘤化學(xué)治療藥物引起腫瘤消除的機(jī)制是促進(jìn)腫瘤細(xì)胞死亡和阻止其增殖，細(xì)胞死亡既可以通過(guò)壞死又可通過(guò)凋亡的形式進(jìn)行［7］。細(xì)胞凋亡成為惡性腫瘤藥物治療的新目標(biāo)，越來(lái)越多的研究成果使人們從細(xì)胞凋亡角度設(shè)計(jì)新的抗腫瘤治療策略、提高藥物治療效果［8］。

Caspase家族在細(xì)胞死亡信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中起核心作用，Caspase-3是Caspase家族中最重要的細(xì)胞凋亡執(zhí)行者之一，在蛋白酶級(jí)聯(lián)切割過(guò)程中它處于核心位置，發(fā)揮著非常重要的作用，一旦被激活就會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，因此被稱為促凋亡蛋白。它可以通過(guò)死亡受體介導(dǎo)途徑與線粒體依賴途徑來(lái)誘發(fā)細(xì)胞凋亡。Caspase-9也是凋亡過(guò)程中的重要蛋白，當(dāng)存在于細(xì)胞膜表面死亡受體與相應(yīng)的配體結(jié)合后，作為起始凋亡蛋白的proCaspase-9被剪切活化為Caspase-9，進(jìn)一步激活下游的Caspase-3蛋白，最終引發(fā)細(xì)胞凋亡［9］。本次研究發(fā)現(xiàn)杠柳苷元可以時(shí)間依賴性地促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)凋亡蛋白Caspase-3的增加并促使凋亡蛋白前體proCaspase-9剪切活化生成Caspase-9，說(shuō)明杠柳苷元發(fā)揮抗腫瘤作用可能是通過(guò)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

1987年Hideji Itokawa等首次報(bào)道香加皮的氯仿一甲醇(10∶1)洗脫部位有抗腫瘤作用并從中分得杠柳苷元［10］，但在此之后關(guān)于杠柳苷元的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究及其抗腫瘤研究并不多見，關(guān)于其抗腫瘤的機(jī)制更是知之有限。本研究通過(guò)蛋白免疫印跡法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)經(jīng)75 μM杠柳苷元作用后的MCF7細(xì)胞中proCaspase-9的表達(dá)量明顯呈時(shí)間依賴性地降低，而Caspase-9的表達(dá)量增加，由此推測(cè)杠柳苷元能夠誘導(dǎo)MCF7細(xì)胞凋亡可能是通過(guò)增加Caspase-9表達(dá)，進(jìn)一步激活下游凋亡蛋白Caspase-3，而 Caspase-3表達(dá)增加，誘導(dǎo)下游蛋白表達(dá)，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

［1］ 中國(guó)科學(xué)院中國(guó)植物志編輯委員會(huì).中國(guó)植物志．北京:科學(xué)出版社，1977:273-274．

［2］ 張?jiān)?，王鋒鵬.杠柳屬植物化學(xué)成分研究進(jìn)展.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2003，15(2):157-161．

［3］ 國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典一部．北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:181．

［4］ Yi-Na Zhu，Wei-Min Zhao，Yi-Fu Yang，et al.Periplocoside E，an Effective Compound from Periploca sepium Bge，Inhibited T Cell Activation in Vitro and in Vivo．The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics，2006，316(2):662-669．

［5］ 李玉紅，高秀梅，張伯禮，等.香加皮提取物對(duì)離體心臟功能的影響．遼寧中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，7(4):396-397．

［6］ 陳書紅，楊峻山，任風(fēng)芝，等.香加皮的抗腫瘤活性成分研究．中草藥，2006，37(4):519-520．

［7］ Park JA，Kin KW，Kin SI，et al.Caspase3 specifically cleaves p21WAF1/C IP1 in the earlier stage of apoptosis in SK-HEP-1 human hepatoma cells．Eur J Biochem，1998;257(1):242-248．

［8］ Kim HE，Oh JH，Lee SK，et al.Ginsenoside Rh2 induces apoptotic cell death in rat C6 gliomal via a reactive oxygen and caspase-dependent but Bcl-X(L)-independent pathway．Life Sci，1999，65(3):33-40．

［9］ Ruiz-Vela A，Korsmeyer SJ.Proapoptotic histone H1.2 induces CASP-3 and-7 activation by forming a protein complex with CYT c，APAF-1 and CASP-9.FEBS Lett，2007，581:3422．

［10］ Hideji Hokawa.Studies on Chemical Constituents of Antitumor Fraction from Periploea Sepium．Chem Pharm Bull，1988，36(3):982-988．