李曉芬，王炯，李橋麗，高云濤，張公信，周學進

(云南民族大學民族藥資源化學國家民委－教育部重點實驗室，云南昆明650500)

沒食子酸清除DPPH自由基的微量電化學滴定

李曉芬，王炯，李橋麗，高云濤，張公信，周學進

(云南民族大學民族藥資源化學國家民委－教育部重點實驗室，云南昆明650500)

電化學研究表明，沒食子酸在石墨電極上有一不可逆的氧化峰，峰電位為Epa=0.48 V，且在0.38 V(vs.SCE)處有一靈敏的差分脈沖伏安氧化峰，其峰電流與濃度具有良好的線性關系，ipa=2.408c+3.028，r=0.999 6.建立了沒食子酸清除DPPH自由基的新型微量電化學滴定法，研究了沒食子酸和DPPH自由基反應的化學計量關系，測得沒食子酸和DPPH自由基反應的化學計量比為1∶3，該結果與光譜分析法相符，并對沒食子酸清除DPPH自由基的電化學氧化機理進行了探討.

沒食子酸;DPPH自由基;電化學滴定;化學計量;電化學氧化機理

沒食子酸(gallic acid，GA)又稱五倍子酸，化學名稱為3，4，5－三羥基苯甲酸，結構見圖1.是一種典型的天然植物酚酸類化合物，也是許多中草藥的有效成分［1－4］.藥理學研究表明，GA具有較強的清除自由基和抗氧化作用，還具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗誘變等功效［5－7］.

1，1－二苯基－2－苦基肼(DPPH)自由基是一種人工合成的穩(wěn)定的自由基，常用于評價物質的抗氧化活性［8－13］.目前活性物質的抗氧化能力多以清除率達50%時的質量濃度IC50值為定量評價指標，但IC50因測定體系和自由基初始濃度不同而有很大差異，且易受測定條件影響，因此發(fā)展一種新的、更可靠的評估方法具有重要意義.本文在對GA電化學氧化機理研究的基礎上提出一種新型微量電化學滴定分析方法，該法在一定量的GA中逐漸定量加入DPPH，記錄加入DPPH后GA氧化峰電流的變化，根據滴定結果計算GA與DPPH反應的化學計量關系，以化學計量關系評價活性物質的抗氧化活性，在此基礎上對GA與DPPH反應機理進行研究.

1 實驗部分

1.1 主要實驗儀器和試劑

MEC－12B多功能微機電化學分析儀(江蘇江分電分析儀器有限公司)，pH－213型酸度計.三電極系統:工作電極為石墨電極，參比電極為飽和甘汞電極(SCE)，對電極為鉑片電極.8453型UV－Vis分光光度計(美國安捷倫公司).

GA標準品(純度﹥99%，購自國藥集團浙江華東醫(yī)藥有限公司);DPPH(1，1－二苯基－2－苦基肼，純度﹥99%，Sigma公司);蘆丁標準品(純度﹥99%，購于Sigma公司);檸檬酸－磷酸氫二鈉緩沖溶液;配制GA (1 mg/mL)、蘆丁(1 mg/mL)和DPPH(0.1 mg/mL，用無水乙醇配制)的標準儲備液，4℃儲存?zhèn)溆?經分光光度法測定，DPPH醇溶液的光吸收值可在1 h內基本不變.所有試劑均為分析純，實驗用水均為二次蒸餾水.

1.2 實驗方法

1.2.1 循環(huán)伏安法(CV)

取一定量的1 mg/mL GA溶液于10 mL比色管中，用0.1 mol/L pH=4.40的檸檬酸－磷酸氫二鈉緩沖溶液稀釋定容，轉移至電解池中，接通三電極系統，在0.1～0.8 V電位范圍內，以70 mV/s的掃速進行循環(huán)伏安掃描，記錄CV曲線.

1.2.2 差分脈沖伏安法(DPV)

取一定量的1 mg/mL GA溶液于10 mL比色管中，用0.1 mol/L pH=4.40的檸檬酸－磷酸氫二鈉緩沖溶液稀釋定容，轉移至電解池中，接通三電極系統，在0.1～0.8 V電位范圍內，以150 ms脈沖寬度、10 mV脈沖幅度、200 ms脈沖間隔進行掃描，記錄DPV曲線.作峰電流與濃度的差分脈沖伏安標準曲線.線性方程為ipa=2.408 c+3.028，r=0.999 6，在濃度為1.0×10－7～7.0×10－5mol/L范圍內ipa與c呈線性關系.

1.2.3 動力學參數的測定

從GA的循環(huán)伏安曲線可獲得電子轉移數n、質子數m、電子轉移系數α和速率常數ks等動力學常數，為推測物質在電極上的電化學氧化反應機理提供了依據.

1.2.4 微量電化學滴定

在含有一定量的GA(5.0×10－5mol/L)溶液中，用微量進樣器以每次10.0 μL逐漸定量加入1.0× 10－3mol/L DPPH，記錄每次滴加DPPH后GA的DPV曲線及其氧化峰電流.根據GA的差分脈沖伏安標準曲線計算GA濃度，根據DPPH加入量與沒食子酸的濃度變化關系繪制電化學滴定曲線，以達到最大清除時DPPH與GA物質的量之比，可以確定DPPH與GA反應的化學計量關系.

1.2.5 DPPH分光光度法標準曲線的繪制

分別取0，0.5，1，2，3，4，5 mL標準液在25 mL比色管中定容至刻度，其質量濃度依次為:0，1，2，4，6，8，10 μg/mL.在516 nm處測定上述標準溶液的吸光度，繪制標準曲線.得到其線性回歸方程為:A=0.027 9 c+ 0.000 8，相關系數r=0.999 8，表明DPPH濃度與其吸光度呈良好的線性關系.

1.2.6 GA對DPPH自由基的清除作用

準確移取4.5 mL DPPH標準液于10 mL比色管中，分別加入不同濃度的GA標準溶液，空白管為4.5 mL DDPH標準液，并用無水乙醇定容至5.0 mL，置于暗處靜置30 min，取出后以無水乙醇為參比于516 nm處分別測定其吸光度.計算其清除率，并與蘆丁進行對照，清除率按下式計算:

式中:A0為空白管的吸光度;A樣為樣品管的吸光度.

2 結果與分析

2.1 循環(huán)伏安(CV)分析

圖2中a是GA的循環(huán)伏安曲線，b、c是GA中加入DPPH溶液后的循環(huán)伏安曲線.從圖2a可知，石墨電極在底液(檸檬酸－磷酸氫二鈉)中不出峰，加入一定量的GA標準溶液后，GA在Epa=0.48 V處出現1個明顯的氧化峰，說明GA在石墨電極上發(fā)生了不可逆的電化學氧化反應，氧化產物不易在電極表面上還原出來.當在GA溶液中加入不同濃度的DPPH時，GA的峰電流明顯減少，DPPH濃度越高，GA峰電流越低，表明GA被DPPH所消耗，同時峰電位也發(fā)生了負移.

2.2 差分脈沖伏安(DPV)分析

GA的差分脈沖伏安圖見圖3中的a曲線所示，GA在0.38 V處有一靈敏的氧化峰，峰電流與GA濃度具有良好的線性關系，ipa=2.408c+3.028(r=0.999 6)，說明通過氧化峰電流可以定量計算GA的濃度.圖3中的b～e曲線是GA中加入不同濃度的DPPH后峰電流的變化，從圖可知，在GA中加入不同濃度的DPPH后，GA的氧化峰電流呈線性減少，可計算出加入量與峰電流的關系.

表1 GA氧化峰電流與掃速的線性關系

2.3 動力學參數的測定

2.3.1 電子轉移數n的測定

電子轉移數n是電極反應參數之一，由圖4及表1可知GA的峰電流和掃速呈線性關系，反應過程又受吸附控制，此吸附體系滿足Laviron理論中Langmuir吸附等溫式:

式中Q為循環(huán)伏安單一過程的峰面積(以電量計);ipa為氧化峰電流;F=96 485 C/mol;R= 8.314 5 J/(K·mol);T=298.15 K;ΓT為吸附量(mol·cm－2);A為石墨電極的面積，約為0.282 6 cm2.由式(1)可知，只需測得某掃描速度下的峰面積和ipa值，即可求得n，從而通過式(2)再求出ΓT.經計算可知，掃速為0.07 V/s時，GA的電子轉移數n為3.01，則吸附量ΓT分別為2.27×10－10mol/cm2.

2.3.2 參加電極反應的質子數m的測定

由圖5和圖6可知，底液的酸度是影響物質峰電位和峰電流的重要因素之一，底液pH值不同，同等濃度的GA在電極上的電化學響應不同，則參與電極反應的質子數m可由底液pH值對峰電位的影響來求得.根據能斯特方程:

由式(3)可知，只需繪制出Epa－pH的關系圖，其斜率k=0.059 m/n(溫度為25℃)，由n即可求解出參加電極反應的質子數m，Epa－pH的線性關系見圖7，線性方程見表2.

由以上研究可知，GA在電極上發(fā)生了3個電子和3個質子的電化學氧化反應，可推知GA的電化學反應為羥基被氧化為酮基的過程，可能的反應機理見圖8.

表2 GA的峰電位Epa與pH值的線性關系

2.4 GA和DPPH的電化學滴定曲線

在5.0×10－5mol/L的GA溶液中逐漸滴加濃度為4.0× 10－4mol/L的DPPH，測定GA的氧化峰電流，根據GA氧化峰電流與濃度關系計算出加入DPPH后GA的濃度變化，繪制DPPH加入量與余下GA的物質的量的關系，結果見圖9所示.從圖9可知，加入DPPH后，GA的氧化峰電流迅速下降，但DPPH加入量達到一定濃度時，GA的氧化峰電流趨于穩(wěn)定，表明所加入的GA很大部分已經被DPPH消耗，其拐點對應達到最大清除時DPPH和GA反應完全時的化學計量點.通過計算化學計量點時DPPH加入量與已消耗GA物質的量的比值，可以確定DPPH與GA的化學計量關系.圖9中2條切線相交的坐標值視為溶液中剩余的GA和加入DPPH的物質的量比.經計算，達到最大清除時，GA與DPPH的化學計量比約為1∶3，也就是說1 mol的GA可以清除約3 mol的DPPH，該計量關系表明了GA清除DPPH的能力，此結果與光譜學研究的結果相符.

通常GA等具有遞電子和遞質子能力的抗氧化劑對DPPH的清除作用是通過抗氧化劑把電子和質子傳遞給DPPH，從而生成穩(wěn)定的分子態(tài)DPPH2［15］，其反應式見圖10.結合GA與DPPH的滴定曲線，在此基礎上可以進一步推出GA和DPPH的電化學反應方程式為圖11.該反應的計量關系與GA和DPPH得失電子數相符.

2.5 GA清除DDPH自由基的光譜學研究

將DPPH在516 nm處的吸光度值與質量濃度作線性回歸分析，得到方程:A=0.027 9 c+0.000 8，其相關系數r=0.999 8，表明DPPH濃度與其吸光度呈正相關關系.GA與蘆丁對DPPH自由基的清除作用見圖12.清除率隨質量濃度的增加逐漸增大，達到一定濃度時，清除率保持穩(wěn)定.當清除率達50%時，GA的質量濃度為:IC50=0.000 92 mg/mL，GA的質量濃度≥0.002 mg/mL時，清除率達最大，為79.17%.當清除率達到50%時，蘆丁的質量濃度為:IC50=0.003 992 mg/mL，蘆丁的質量濃度≥0.008 mg/mL時，清除率達最大為74.46%.這說明GA對DPPH自由基有較強的清除作用，且明顯強于相同濃度下的蘆丁.在光譜學研究中，DPPH為2.739 mmol時樣品達最大清除率所消耗的GA是0.93 mmol，二者比例為1∶3，此結果與電化學研究的結果相符.光譜法IC50值和最大清除率80%的結果也與微量電化學滴定法獲得的化學計量結果相符，因此證明微量電化學計量法用于評定活性物質的抗氧化活性是可靠的.

3 結論

本文提出一個新的測定和評價物質抗氧化活性的微量電化學滴定方法.該方法能獲得抗氧化劑與自由基的化學計量關系，利用該化學計量關系可更好的評價抗氧化劑清除自由基的活性，解決了常規(guī)的IC50評價方法受體系和自由基初始濃度影響較大的不足.該方法具有穩(wěn)定可靠、快速簡便、靈敏度高的特點.本文提出的微量電化學滴定法還能獲得抗氧化劑和自由基反應機理的微觀信息，較常規(guī)的光譜方法具有明顯的優(yōu)勢.

［1］狄瑩，石碧.植物多酚［M］.北京:科學出版社，2000:11－12.

［2］KUMAR R A，JAYARAMAN A，LAKSHMANAN M，et al.Bioconversion of gallic acid into pyrogallol by immobilized Citrobacter freundii TB3［J］.Journal of Fermentation and Bioengineering，1992，74(3):159－162.

［3］戴勇.3，4，5－三甲氧基苯甲醛的合成工藝改進［J］.鹽城工學院學報:自然科學版，2007，20(4):1－3

［4］呂麗麗.電子級沒食子酸制備過程中若干基礎問題研究［D］.杭州:浙江大學，2008.

［5］朱艷媚.余甘子的研究進展［J］.中華實用中西醫(yī)雜志，2007，20(7):622－623.

［6］許紅巖，王麗莉，王彥懷，等.沒食子酸在Nafion/單壁碳納米管/聚(3－甲基噻吩)復合膜修飾電極上電化學行為及測定［J］.傳感技術學報，2008，21(7):1113－1118.

［7］季宇彬.中藥有效成分藥理與應用［M］.哈爾濱:黑龍江科學技術出版社，1995.

［8］王和才，胡秋輝.DPPH法測定紫紅薯提取物清除自由基的能力［J］.食品研究與開發(fā)，2010，31(1):132－134.

［9］莫緒生，鄒碧群，劉賢賢，等.麻風樹籽初提取物對DPPH自由基的清除能力研究［J］.桂林師范高等專科學校學報，2010，24(2):174－175.

［10］陸艷麗，管毓相，方玉梅，等.千里光黃酮類化合物清除DPPH自由基的作用［J］.食品科技，2010，35(3):197－199.

［11］鄭善元，陳填烽，鄭文杰，等.單叢茶水提物清除DPPH和ABTS自由基的光譜學研究［J］.光譜學與光譜分析，2010，30(9):2418－2422.

［12］黃思梅，張鏡.海南蒲桃原花青素DPPH自由基清除活性及穩(wěn)定性的初步研究［J］.食品科技，2010，35(3):204－206.

［13］張逸波，鄭文杰，黃峙，等.硒雜環(huán)化合物SPO清除DPPH和ABTS自由基的光譜學研究［J］.光譜學與光譜分析，2010，30(7):1866－1871.

［14］LAVIRON E.General expression of the linear potential sweep voltammogram in the case of diffusionless electrochemical systems［J］.J Electroanal Chem，1979，101(l):19－28.

［15］楊盈，嚴寶珍，聶舟，等.α－生育酚與自由基DPPH的反應機理的研究［J］.波譜學雜志，2008，25(3):331－336.

(責任編輯戴云)

Micro－Electrochemical Titration Analysis of the Scavenging Effect of Gallic Acid on DPPH Free Radicals

LI Xiao-fen，WANG Jiong，LI Qiao-li，GAO Yun-tao，ZHANG Gong-xin，ZHOU Xue-jin
(Key Laboratory of Chemistry in Ethnic Medicinal Resources，State Ethnic Affairs Commission and Ministry of Education，Yunnan University of Nationalities，Kunming 650500，China)

The electrochemical results indicated that gallic acid presented typical irreversible oxidation processes，and an irreversible oxidation peak was observed with the peak potentials of 0.48V(vs.SCE)on the graphite electrode.A sensitive differential pulse voltammetry anodic peak at Epa=0.38V(vs.SCE)was also detected with a good linear relationship between the peak current and the concentration:ipa=2.408 c+3.028，r=0.999 6.A novel micro－electrochemical titration method for evaluating the scavenging effect of gallic acid on DPPH free radicals was proposed，the stoichiometric relationship of gallic and DPPH was determined with a stoichiometric proportion of 1∶3(gallic to DPPH)，which was coincident with the results of spectrophotometry.Electrochemical oxidation mechanism of the scavenging effect of gallic acid on DPPH free radicals was also investigated.

gallicacid;DPPHfreeradical;electrochemicaltitration;stoichiometry;electrochemical oxidation mechanism

O 657.7;R 284.1

A

1672－8513(2012)04－0243－06

10.3969/j.issn.1672－8513.2012.04.003

2011－08－29.

云南省創(chuàng)新團隊項目(2011HC008);民族藥資源化學國家民委－教育部重點實驗室開放基金(MJY07010).

李曉芬(1986－)，女，碩士研究生.主要研究方向:分析化學.

高云濤(1962－)，男，教授，碩士生導師.主要研究方向:分析化學.