郭志云，楊 光，荊春霞，付芹芹，孫小會，王穗湘，李月琴，周天鴻

隱孢子蟲（Cr yptosporidiu m spp．）是一種呈世界性分布的人獸共患寄生蟲，已成為世界范圍內(nèi)水源傳播疾病中的重要病原體，它能感染人和許多動物，嚴重危害著人類的健康和畜牧業(yè)的發(fā)展［1］。隱孢子蟲機會性感染是AIDS病患者的重要致死原因，而目前還沒有有效的治療和預(yù)防方法［2］。近幾年，隨著全基因組測序計劃的不斷發(fā)展，隱孢子蟲已有3個分離株（C．parvu m Iowa II，C．hominis TU502和C．muris）的全基因組測序工作完成［3－4］，圍繞隱孢子蟲基因結(jié)構(gòu)和功能的研究迅速成為熱點。

EF－h(huán)and （Exchange Factor hand）結(jié) 構(gòu) 域（PROSITE entry：PDOC00018，Ex PASy）是一種含有鈣離子結(jié)合位點的α螺旋－中央環(huán)－α螺旋（alpha helix－loop－alpha helix）結(jié)構(gòu)，兩股α螺旋分別稱為“E”和“F”，且?guī)缀跏谴怪钡模@有利于中央環(huán)與Ca2＋結(jié)合而發(fā)生構(gòu)象的改變，進而暴露靶結(jié)合位點而發(fā)揮生物學功能［5－6］。EF－h(huán)and motif約含有 40個氨基酸殘基，常以成對形式出現(xiàn)在蛋白功能域中，與重要的鈣離子信號有著密切的關(guān)系［7］。

我們在對隱孢子蟲進行基因功能研究的過程中，發(fā)現(xiàn)C．par vu m Iowa II基因組中含有大量EF－h(huán)and結(jié)構(gòu)域蛋白。為了更好地分析這類含有EF－h(huán)and結(jié)構(gòu)域的蛋白的功能及其對微小隱孢子蟲的重要意義，本文對微小隱孢子蟲該蛋白家族進行了生物信息學相關(guān)分析，為進一步基因功能研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 數(shù)據(jù)收集 在美國隱孢子蟲基因組數(shù)據(jù)庫（htt p：／／cr yptodb．or g／cr yptodb／）中 “Gene Text Search”信息欄輸入EF－h(huán)and，初步搜索C．par vu m Iowa II基因組中推定的含有EF－h(huán)and結(jié)構(gòu)域的蛋白，結(jié)合 Gen Bank中的核酸數(shù)據(jù)庫（http：／／www．ncbi．nl m．nih．gov／）獲得各蛋白相應(yīng)的核苷酸序列及蛋白序列。

1．2 結(jié)構(gòu)域和motif分析 將搜索獲得的蛋白序列輸入到NCBI的結(jié)構(gòu)域搜索網(wǎng)站CDD（http：／／www．ncbi．nl m．nih．gov／Str ucture／cdd／wrpsb．cgi）中進行各蛋白的結(jié)構(gòu)域搜索，以進一步確定和分析各蛋白含有EF－h(huán)and結(jié)構(gòu)域以及其他結(jié)構(gòu)域的情況。同時還進行Sanger網(wǎng)站的Pfam搜索（http：／／pf am．sanger．a(chǎn)c．uk／）驗證結(jié)構(gòu)域搜索結(jié)果。通過日本京都大學開發(fā)的Motif Search在線搜索工具（http：／／www．geno me．jp／tools／motif／），對每個蛋白進行了motif搜索。

1．3 序列比對 利用NCBI BLAST功能中的Blast－N和Blast－P對經(jīng)過結(jié)構(gòu)域搜索確定含有EF－h(huán)and結(jié)構(gòu)域的蛋白進行核苷酸和氨基酸序列比對，以確保所收集得到的數(shù)據(jù)的準確性。在缺省值條件下使用Cl ustal W軟件（版本號是1．83）對每個蛋白的EF－h(huán)and結(jié)構(gòu)域進行多序列聯(lián)配分析，以進一步了解微小隱孢子蟲中EF－h(huán)and結(jié)構(gòu)域間的相似性和研究EF－h(huán)and結(jié)構(gòu)域中的Ca2＋binding site等重要殘基相關(guān)信息。

1．4 計算蛋白的分子量、等電點和氨基酸長度 將目的蛋白序列輸入到 Ex PASy（http：／／www．expasy．ch／t ools／pi＿tool．ht ml）進行蛋白的分子量和等電點計算，以比較EF－h(huán)and家族蛋白之間基本性質(zhì)的區(qū)別。

1．5 蛋白功能分析 通過各蛋白所含有的結(jié)構(gòu)域情況，對C．par vum Iowa II中的 EF－h(huán)and結(jié)構(gòu)域蛋白進行大致分類。利用結(jié)構(gòu)域畫圖軟件DOG 2．0（Do main Graph，version 2．0，（Do main Graph，version 2．0，http：／／dog．biocuckoo．org／soft ware．php）畫出上述蛋白所含有的結(jié)構(gòu)域以及鈣離子結(jié)合位點和其他相關(guān)重要位點情況，進行蛋白之間的比較與分析，最后結(jié)合NCBI的Blast比對結(jié)果和文獻分析進行功能預(yù)測。

2 結(jié) 果

2．1 含EF－h(huán)and結(jié)構(gòu)域蛋白的初篩 在微小隱孢子蟲基因組數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)收集過程中，在C．parvum Iowa II的全基因組中搜索獲得數(shù)據(jù)庫中注釋的含有EF－h(huán)and結(jié)構(gòu)域的53個蛋白，經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn)其中15個蛋白是假設(shè)蛋白，故將獲得的除去假設(shè)蛋白的38個含EF－h(huán)and結(jié)構(gòu)域的蛋白作為進一步分析的目標蛋白。

2．2 含EF－h(huán)and結(jié)構(gòu)域蛋白的確定 將這38個蛋白的蛋白序列輸入到NCBI的結(jié)構(gòu)域搜索網(wǎng)站中進行CDD結(jié)構(gòu)域搜索與分析時，發(fā)現(xiàn)這38個蛋白中只有18個蛋白真正含有EF－h(huán)and結(jié)構(gòu)域，其余20個蛋白均未發(fā)現(xiàn)EF－h(huán)and結(jié)構(gòu)域的存在。將此未發(fā)現(xiàn)EF－h(huán)and結(jié)構(gòu)域的20個蛋白序列輸入到sanger網(wǎng)站進行Pfam結(jié)構(gòu)域搜索，結(jié)果仍未搜索到EF－h(huán)and結(jié)構(gòu)域，推測在微小隱孢子蟲基因組數(shù)據(jù)庫中的全基因組進行注釋時并未精確分類這些蛋白。因此對這18個真正含有EF－h(huán)and結(jié)構(gòu)域的蛋白進行深入分析（表1）。

2．3 蛋白的基本性質(zhì)分析 經(jīng)過Ex PASy的分子量和等電點分析，這18個蛋白之間的氨基酸長度、分子量大小以及等電點等都有很大的區(qū)別，它們的氨基酸長度從149－1042 AA，分子量從16．8－115．6k D，pI值從4．09－8．96，呈現(xiàn)著明顯的區(qū)別。EF－h(huán)and家族的染色體定位分析表明，該家族蛋白分布在C．par vu m Iowa II的1、2、3、5、7與8號染色體上，其中在3號染色體上1個，1號染色體上有2個，5號、7號和8號染色體上各有3個，分布最多的是2號染色體6個，4號和6號染色體上未發(fā)現(xiàn)此類蛋白的存在。而且，除cgd1－1370含有1個內(nèi)含子之外，其余17個蛋白未見內(nèi)含子的存在（表1）。

2．4 結(jié)構(gòu)域和motif分析 通過CDD結(jié)構(gòu)域搜索發(fā)現(xiàn)，在這18個蛋白中，有9個蛋白含有2個EF－h(huán)and結(jié)構(gòu)域，分別為cgd2－810、cgd8－1280、cgd5－60、cgd1－1370、cgd8－4120、cgd2－1240、cgd5－820、cgd7－1840和cgd2－1300。而另外9個蛋白只含有1個 EF－h(huán)and結(jié)構(gòu)域，分別是cgd2－1700、cgd8－500、cgd5－3920、cgd3－3420、cgd2－3990、cgd1－3220、cgd7－40、cgd2－1060和cgd7－1260。除 EF－h(huán)and結(jié)構(gòu)域外，cgd5－820、cgd7－1260 和 cgd2－1300還含有PKC（protein kinase C）結(jié)構(gòu)域，cgd2－1060和 cgd7－1840 還 含 有 STKc－AGC〔serine／t hreonine kinases（STKs），AGC （pr otein kinases A，G and C f amily，catal ytic do main〕結(jié)構(gòu)域，且cgd7－1840還含有一個CBM20（The fa mil y 20 carbohydrate－binding module，also known as the starch－binding domain）結(jié)構(gòu)域（圖1）。

表1 微小隱孢子蟲基因組中含有EF－h(huán)and結(jié)構(gòu)域的18種蛋白的基本信息Tab．1 General infor mation about the 18 kinds of pr otein which containd EF－h(huán)and domains of the C．parvum Iowa II genome

圖1 微小隱孢子蟲含有EF－h(huán)and結(jié)構(gòu)域蛋白的結(jié)構(gòu)域示意圖Fig．1 The domain condition of the 18 proteins containing EF－h(huán)and domains from the C．parvum Iowa IINote：This result was obtained in March 2011 online．Due to the update of the website，there is a certain difference in the results bet ween before and after search．EFh：EF－h(huán)and domain；EH：Eps15 homology domain（EFh superfamily）．

經(jīng)motif搜索發(fā)現(xiàn)，18個蛋白都含有EF－h(huán)and－1 Motif，其一致模式為D－｛W｝－［DNS］－｛ILVFY W ｝－［DENSTG ］－［DNQGHRK ］－｛GP ｝－［LIV MC］－［DENQSTAGC］－x（2）－［DE］－［LIVMFY W］（PROSITE entr y：PS00018；“｛｝”表示除了括號內(nèi)的任何一個氨基酸都可以，“［］”表示括號內(nèi)的任何一個氨基酸都可以，“x”表示所有氨基酸中的任何一個，“x（2）”表示此位點兩個重復(fù)氨基酸，“－”為分隔符），包括了13個氨基酸殘基，其中，位點1、3、5、7、9和12（圖2）都是和Ca2＋結(jié)合相關(guān)的重要位點，尤其是位點12上固定不變的帶負電荷的Asp（D）或Glu（E）可以通過電荷之間的相互作用與帶正電荷的Ca2＋結(jié)合，并提供2個氧給Ca2＋以促進Ca2＋的 結(jié) 合 （http：／／pfam．sanger．a(chǎn)c．uk／family／PF00036．26）。通過 Clustal W 1．83軟件進行的EF－h(huán)and結(jié)構(gòu)域多序列聯(lián)配分析發(fā)現(xiàn)，本文所分析的18個蛋白的EF－h(huán)and結(jié)構(gòu)域均由一對EF－h(huán)and motif構(gòu)成，都符合EF－h(huán)and－1 Motif的一致模式，其中位點1上幾乎均為D（Asp）氨基酸，位點12上幾乎都是E（Glu）和D（Asp）氨基酸（圖2），這就揭示了EF－h(huán)and motif在氨基酸序列上的保守性，進一步說明這些位點是結(jié)構(gòu)域的重要位點。

還發(fā)現(xiàn)，cgd2－3990的羧基末端還含有一個ER－TARGET motif （endoplas mic reticulu m－targeting signal sequence）RDE，稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）滯留信號的4肽信號序列，它的一致模式為［KRHQ－SA］－［DENQ］－E－L（PROSITE：PS00014），帶 有 此滯留信號的蛋白被稱為ER定居蛋白，在ER腔、高爾基體及其中間區(qū)分布有ER－TARGET motif的受體，ER定居蛋白一旦進入高爾基體就會被高爾基體上的受體結(jié)合，形成回流小泡被轉(zhuǎn)運回內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，從而將錯誤轉(zhuǎn)運到分泌囊泡中的ER定居蛋白重新轉(zhuǎn)運回ER腔［8］。此外cgd5－820、cgd7－1840、cgd2－1300、cgd2－1060、cgd7－40和cgd7－1260這6個蛋白都含有一個PROTEIN＿KINASE＿ST motif（PROSITE：PS00108）和一個PROTEIN＿KINASE＿ATP motif（PROSITE：PS00107）。PROTEIN＿KINASE＿ST motif是一個 Serine／Threonine protein kinases active－site signat ure，而 PROTEIN＿KINASE＿ATP motif是一個Pr otein kinases ATP－binding region signature，除 cgd7－40 之外，這些motif剛好是和它們所含有的PKc或STKc－AGC蛋白激酶催化結(jié)構(gòu)域相一致的。因此，我們可以發(fā)現(xiàn)，motif和domain雖然是兩個不同的概念，但是兩者之間是密切相關(guān)的，正是因為motif這些保守性的殘基組成了do main。

圖2 微小隱孢子蟲18個蛋白的EF－h(huán)and結(jié)構(gòu)域多序列聯(lián)配分析Fig．2 Multiple sequence align ment of the EF－h(huán)and domain from the 18 proteins of the C．parvum Iowa IINote：The domain sequence is named according to the complete genome database’s gene names；the 1 and 2 represent t his pr otein’s t wo EF－h(huán)and do mains．

2．5 蛋白分類情況 PKC結(jié)構(gòu)域是蛋白激酶催化結(jié)構(gòu)域（protein kinases catalytic domain），能夠催化ATP上的γ－磷酰基團向蛋白底物的絲氨酸／蘇氨酸／酪氨酸殘基轉(zhuǎn)移，使絲氨酸／蘇氨酸／酪氨酸被磷酸化；而STKc－AGC結(jié)構(gòu)域為絲氨酸／蘇氨酸激酶 （serine／t hreonine kinases，STKs）－蛋白激酶 A、G、C 家族 （protein kinases A，G，and C family，AGC）催化結(jié)構(gòu)域，是蛋白激酶超家族中A、G、C家族的絲氨酸／蘇氨酸激酶催化結(jié)構(gòu)域，只能催化ATP上的γ－磷酰基團向蛋白底物的絲氨酸／蘇氨酸殘基的轉(zhuǎn)移，使絲氨酸／蘇氨酸發(fā)生磷酸化（http：／／www．ncbi．nl m．nih．gov／Str ucture／cdd／cddsrv．cgi）；而成對出現(xiàn)的EF－h(huán)and結(jié)構(gòu)域會比單一EF－h(huán)and結(jié)構(gòu)域更穩(wěn)定，且在對Ca2＋的結(jié)合上起著協(xié)同作用［9］。因此基于所含有的結(jié)構(gòu)域情況可以簡單地把這18個蛋白分成a、b、c和d四大類（見圖1）：a類為只含有1個EF－h(huán)and結(jié)構(gòu)域的蛋白，b類為只含有2個EF－h(huán)and結(jié)構(gòu)域的，c類為同時含EF－h(huán)and和STKc－AGC兩種結(jié)構(gòu)域的，d類為同時含EF－h(huán)and和PKC兩種結(jié)構(gòu)域的蛋白。

3 討 論

自從微小隱孢子蟲（C．par vu m）8條染色體的全基因測序工作［3－4］完成之后，隱孢子蟲的研究已進入了后基因組時代，大量新基因的發(fā)現(xiàn)為科研工作者提供了更多的研究方向。其中許多的序列信息只進行了簡單的注釋，利用生物信息學相關(guān)知識來分析和預(yù)測蛋白的功能已成為很多課題研究的基礎(chǔ)。本研究從與蛋白功能密切相關(guān)的結(jié)構(gòu)域信息出發(fā)，通過研究隱孢子蟲中EF－h(huán)and家族蛋白的結(jié)構(gòu)域情況去預(yù)測這些蛋白的功能，為后續(xù)進行的微小隱孢子蟲中鈣離子代謝的研究提供了更多的方向。

Ca2＋信號是真核細胞中最廣泛存在的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制之一，細胞受到刺激后，儲存的Ca2＋就會被快速釋放，引起下游一系列的效應(yīng)，而這些效應(yīng)一般由EF－h(huán)and蛋白超家族通過各種途徑參與執(zhí)行［10］。EF－h(huán)and蛋白是一類同源蛋白，一般含有2到12個拷貝的EF－h(huán)and結(jié)構(gòu)域，按功能可以分為兩類，一類為結(jié)合Ca2＋后能發(fā)生構(gòu)象改變起到調(diào)控作用的信號蛋白，包括鈣調(diào)蛋白（cal modulin）、肌鈣蛋白C（tr oponin C）和S100B蛋白等；另一類為如鈣結(jié)合蛋白（calbindin）和小清蛋白（Parvalbu min）樣只起到緩沖胞內(nèi)Ca2＋水平的結(jié)構(gòu)蛋白，它們不會發(fā)生Ca2＋依賴的構(gòu)象改變［11］。對于本研究中的這18個蛋白，基于美國隱孢子蟲基因組數(shù)據(jù)庫的注釋和同源性分析，cgd2－810、cgd2－1700、cgd5－3920 和cgd3－3420屬于鈣調(diào)蛋白家族，因此它們屬于起到調(diào)控作用的信號蛋白；cgd8－500、cgd8－1280、cgd5－60和cgd8－4120屬于中心體蛋白家族（centrin，在某些生物又叫做鈣牽蛋白，caltractin），centrins在結(jié)合Ca2＋之后發(fā)生的構(gòu)象改變，很有可能為紡錘極體（spindle pole body）的復(fù)制提供信號，并提高了centrins對相互作用的目的蛋白的親和力［12］，因此這類蛋白應(yīng)該都屬于信號蛋白；而cgd5－820、cgd7－1840、cgd2－1300、cgd2－1060、cgd7－40和cgd7－1260都屬于CDPK （calciu m／cal modulin－dependent protein kinase）蛋白，由于 EF－h(huán)and結(jié)構(gòu)域和protein kinase結(jié)構(gòu)域之間存在信息傳遞關(guān)系，也應(yīng)都屬于信號蛋白；cgd1－1370是磷酸酶B亞單位（calcineurin subunit B，Cn B），雖然在結(jié)合Ca2＋之后并不經(jīng)歷Ca2＋誘導(dǎo)的構(gòu)象改變，但它是一個獨立的Ca2＋傳感器，能夠調(diào)控Ca2＋依賴的和非Ca2＋依賴的兩種形式磷酸酶［13］，所以是一個信號蛋白；cgd2－1240和cgd1－3220，目前尚無相關(guān)功能研究的資料支撐其分類；cgd2－3990是一個膜相關(guān)的Ca2＋依賴的ER定居蛋白，與Pl asmodiu m f alcipar u m的Pfs40蛋白結(jié)構(gòu)非常相似，而Pfs40是Pl asmodium f alcipar um 配子主要的Ca2＋結(jié)合蛋白，Ca2＋調(diào)控的結(jié)構(gòu)改變很有可能是其細胞識別和聚合所必須的分子相互作用［14］，所以cgd2－3990也是一個信號分子。因此，我們推測，此EF－h(huán)and家族除cgd2－1240和cgd1－3220尚未有相關(guān)資料來支撐分類之外，其余的16個蛋白都屬于信號蛋白，但這只是基于生物信息學的初步分類，而進一步的確定還需要對各個蛋白進行如Ca2＋放射自顯影等相關(guān)的體外實驗來說明。

Ca2＋信號控制著頂復(fù)門寄生蟲生活史中很多重要的過程，如粘附素的分泌、蟲體的滑行運動、對宿主細胞的入侵和逃出等，而蛋白激酶是下游Ca2＋水平變化的效應(yīng)器，Ca2＋向胞質(zhì)的快速釋放將會活化Ca2＋依賴的蛋白激酶家族（CDPKs）［15］。在植物和一些原生動物中已發(fā)現(xiàn)，CDPKs能夠接收Ca2＋信號而在細胞中扮演著非常重要的角色，經(jīng)典的CDPKs結(jié)構(gòu)域含有一個能對靶蛋白進行磷酸化作用的激酶催化區(qū)（kinase catalytic region）和大量的C末端EF－h(huán)and結(jié)構(gòu)域（通常為4個EF－h(huán)and motifs），它們中間是一個短的自動抑制結(jié)構(gòu)域，正常情況下，這個自動抑制結(jié)構(gòu)域充當假底物的身份，和蛋白激酶結(jié)構(gòu)域結(jié)合在一起從而抑制蛋白激酶結(jié)構(gòu)域的功能，當Ca2＋結(jié)合到EF－h(huán)and結(jié)構(gòu)域之后，這種自動抑制作用就會被解除，從而發(fā)揮Ca2＋依賴的蛋白激酶家族蛋白各種功能［16－17］。本文中含有CDPKs結(jié)構(gòu)域（PKc和STKc－AGC）的5個 EF－h(huán)and蛋白中，有3個蛋白在蛋白激酶催化結(jié)構(gòu)域后面緊跟著2個 EF－h(huán)and結(jié)構(gòu)域即4個 EF－h(huán)and motifs，且PKc和STKc－AGC結(jié)構(gòu)域都具有活化位點（active site）、ATP結(jié)合位點（ATP binding site）以及底物結(jié)合位點（substrate binding site）。CDPKs作為一切生命活動的基礎(chǔ)，控制著細胞內(nèi)如轉(zhuǎn)錄、新陳代謝、離子泵與離子通道和細胞骨架的構(gòu)建等一系列的過程［18］，所以在C．par vu m Iowa II中應(yīng)該是這類EF－h(huán)and家族蛋白起著最重要的作用，且它們這種強大功能的發(fā)揮是依賴于這些蛋白激酶催化結(jié)構(gòu)域的。

大量的研究還證明，Ca2＋調(diào)控著瘧原蟲不同的生物過程，如裂殖子對紅細胞的入侵，動合子和子孢子的運動與細胞侵襲，分泌細胞器的脫落，以及在蚊體內(nèi)的性分化過程［19－20］。Toxopl asma gondii 的體外試驗也證明，寄生蟲侵入宿主細胞前的細胞附著作用是與頂復(fù)門特有的微線體黏附蛋白（micr oneme proteins）密切相關(guān)的，而微線體黏附蛋白的分泌又受到胞質(zhì)Ca2＋水平的調(diào)控［15］。還有實驗證明，C．par vu m子孢子侵入宿主細胞之前需要進行Ca2＋依賴的頂復(fù)器的脫落是［20］，因此C．parvu m對宿主細胞的侵襲與胞內(nèi)的Ca2＋信號有著非常重要的關(guān)系。在隱孢子蟲基因組中EF－h(huán)and蛋白家族如此地龐大，暗示著鈣離子信號在隱孢子蟲的整個生命活動中起著非常重要的作用，EF－h(huán)and蛋白很有可能成為今后隱孢子蟲病治療的一個藥物靶點。鑒于本文前面的討論，cgd5－820、cgd7－1840、cgd2－1300、cgd2－1060、cgd7－1260、cgd1－1370和cgd2－3990這7個蛋白很有可能在隱孢子蟲的生活史中起著關(guān)鍵的作用。尤其是cgd2－3990和cgd1－1370兩個蛋白，cgd2－3990很有可能與隱孢子蟲配子體的形成和作用有著密切的關(guān)系［14］，而cgd1－1370作為Calcineurin的一個調(diào)節(jié)亞基，且已有研究證明Calcineurin B對免疫系統(tǒng)有明顯的刺激作用，是T細胞的活化過程必不可少的，在老鼠身上也證明了Calcineurin B的顯著抗癌效應(yīng)，所以cgd1－1370很有可能成為隱孢子蟲病治療的藥物靶點［13］，這7個蛋白將會成為今后深入研究的方向。

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