黨裔武，容敏華，陳 罡△

（1.廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院病理科，南寧530021；2.廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院實驗研究部，南寧530021）

肝癌石蠟包埋組織miRNA提取方法的優(yōu)化＊

黨裔武1，容敏華2，陳 罡1△

（1.廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院病理科，南寧530021；2.廣西醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院實驗研究部，南寧530021）

目的改進并優(yōu)化從肝癌（HCC）甲醛固定石蠟包埋組織（FFPE）提取并檢測微小RNA（miRNA）的方法。方法使用miRNeasy FFPE試劑盒探討提取HCC石蠟組織miRNA最佳切片厚度及蛋白酶K作用時間。實時定量RT－PCR檢測miR－221、miR－146a、let7－a、miR－191、miR－103及RNU6B的表達量。將 HCC細胞制成石蠟組織，對比同一細胞系新鮮細胞及石蠟包埋細胞的各個miRNA表達量差異。結(jié)果切片厚度30μm，蛋白酶K作用時間48h時提取miRNA效果最佳。各HCC細胞系及臨床 HCC石蠟組織均有不同水平的 miRNA－221、miR－146a、let7－a、miR－191、miR－103及 RNU6B表達。同一細胞系新鮮細胞與石蠟包埋后的各miRNA表達無明顯差別。結(jié)論改良后的miRNeasy FFPE提取方法能提取石蠟組織中的miRNA，可重復(fù)性強，可推廣用于臨床各種石蠟包埋組織的miRNA提取。

微RNAs；甲醛；石蠟包埋；肝腫瘤；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)

微小RNA（microRNA，miRNA）是一組微小的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNAs（21－25nt），由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約70～90個堿基大小的單鏈RNA前體經(jīng)過Dicer酶加工后而生成。miRNA現(xiàn)已被證實在不同的生理過程，諸如發(fā)育、分化、增殖、凋亡及病毒感染中發(fā)揮著重要的作用［1－5］。最新研究表明，有部分miRNA與肝癌（hepatocellalar car einoma，HCC）等腫瘤的關(guān)系密切。一些HCC組織特異性的miRNA亦被證實在HCC的發(fā)生過程中起到了非常重要的調(diào)節(jié)作用［6－10］。臨床甲醛固定石蠟包埋（formalin－fixed paraffin－embedded，F(xiàn)FPE）標本是進行醫(yī)學回顧性研究的最佳資源。雖然新鮮臨床標本經(jīng)過固定、脫水、浸蠟、包埋等步驟后，mRNA部分已降解或修飾，但從FFPE提取總mRNA進行醫(yī)學研究仍得到了長足的進展［11－12］。miRNA因為本身體積微小，故在FFPE組織中保存相當穩(wěn)定，與新鮮組織樣品中miRNA相差無幾，因此使用FFPE組織進行相關(guān)miRNAs的研究已成為當前的熱點。本實驗使用miRNeasy FFPE試劑盒探討提取肝癌石蠟組織miRNA最優(yōu)化的條件，并對比使用該方法提取的石蠟標本miRNA表達與相應(yīng)的新鮮細胞的miRNA表達的差異，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 人 HCC細胞系 HepG2，HepB3，SNU449及SNU398均購自美國ATCC公司，分別用DMEM與RPMI 1640培養(yǎng)液（均購自美國Gibcol公司）培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞（約1×107），以1 000r／min離心5min，去上清液；D－Hanks平衡鹽溶液（pH 7.2）清洗2遍；最后一次吸出上清液后，沿離心管管壁慢慢地加入1滴蛋清甘油（蛋清∶甘油＝1∶1），用滴管輕輕地把細胞與蛋清甘油混勻，將細胞用10%中性緩沖甲醛固定12h，低速離心（200r／min）5min；離心后的細胞團用擦鏡紙包裹，然后進行各級乙醇脫水（各30min）、二甲苯透明（2×30min）、浸蠟（3×30min）及石蠟包埋［18］。石蠟組織標本40例，為廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院病理科確診的HCC患者，均含有距癌結(jié)節(jié)2cm以上之癌旁組織。

1.2 FFPE組織含miRNA總RNA的提取 miRNeasy FFPE Kit購自比利時Qiagen分公司。按試劑說明書操作并進行相關(guān)步驟不同參數(shù)的測試，簡述如下:（1）蠟塊分別切片5、10、20、30、40μm厚，根據(jù)組織大小將2～16張切片置于無RNA酶的EP管中，加二甲苯1mL，劇烈振蕩10s，20℃下14 000 r／min離心2min，棄上清液。視石蠟多少重復(fù)上述步驟1～3次；（2）加1mL無水乙醇，振蕩混勻，14 000r／min離心2min，棄上清液；（3）風干后加240μL PKD緩沖液及10μL蛋白酶K，振蕩混勻，視組織溶解情況55℃分別孵育15min、1、12、24、36、48h。如組織不溶解，則于24h時再加10μL蛋白酶K，繼續(xù)孵育12～24h，然后80℃15min；（4）加500μL RBC緩沖液，振蕩混勻，將液體全部轉(zhuǎn)移至gDNA Eliminator離心管，10 000r／min離心30s，棄離心管，保留離心后液體；（5）加入無水乙醇1.2mL，混勻，將700μL移至miRNeasy Min E－lute離心管，10 000r／min離心15s，棄離心液，重復(fù)上述過程至全部樣本離心完畢；（6）加500μL RPE緩沖液，10 000r／min離心15s，棄離心液，重復(fù)上述步驟，但第2次離心2min；（7）將miRNeasy Min Elute離心管置入新的收集管，14 000r／min離心5min，棄離心液；（8）將miRNeasy Min Elute離心管置入最后的RNA收集管，加30μL無RNase 14 000r／min離心1min溶解總RNA（含 miRNA），使用ND－1000Nano Drop檢測RNA質(zhì)量及濃度。

1.3 實時定量RT－PCR技術(shù)檢測miRNA表達 miRNA檢測引物、探針（miR－221、miR－146a、let7－a、miR－191、miR－103和RNU6B）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及實時定量RT－PCR試劑盒購自Applied Biosystems公司。細胞總RNA（含miRNA）使用 miRNeasy Mini Kit（比利時Qiagen分公司）抽提。取各組總RNA各200ng，加入到含特異引物的15μL的RT反應(yīng)體系中行miRNA逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。取2μL cDNA樣本使用 ABI－Prism 7900HT PCR儀（Applied Biosystems）行實時定量PCR檢測。所有實驗重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS19.0軟件進行分析，計量資料以±s表示，兩兩比較采用LSD法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 總RNA純度 所有標本不同條件下抽提的總RNA（含miRNA）OD260／OD280值均在1.80～2.06之間，OD260／OD230值均在1.89～2.08之間。

2.2 切片厚度與 miRNA表達的關(guān)系 HepG2、HepB3、SNU449及SNU398細胞均制成蠟塊，并選取3例HCC病例及其對應(yīng)癌旁正常肝組織進行不同厚度與miRNA表達量關(guān)系的測試。10個蠟塊不同切片厚度均能檢測出相關(guān)miRNA的表達。但5μm厚的切片Cq值明顯高于其他厚度切片，miRNA表達量下降。同一miRNA表達量最高者均為厚30 μm的切片，Cq值低于5μm者1～2循環(huán)不等。30μm組與其他組別相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。從5、10μm至20、30μm，各個miRNA的表達量呈現(xiàn)上升趨勢，但40μm厚之切片miRNA表達略低于30μm者。HepG2及其中1例HCC和癌旁肝組織各miRNA表達，見圖1。

2.3 蛋白酶K作用時間與miRNA表達的關(guān)系 試劑盒說明書建議蛋白酶K 55℃孵育15min，但孵育15min后肉眼仍可見明顯的組織塊，將孵育時間增加至1h，組織塊仍未消失。故將孵育時間延長至12～24h，直至液體呈現(xiàn)清亮。如一次抽提的組織較多，在24h時補加一次蛋白酶K，繼續(xù)孵育12～24 h。為觀察蛋白酶K作用時間對miRNA表達的影響，選取1例HCC蠟塊（表面積200mm2），每次切片2張，厚30μm，該例首次加蛋白酶K 24h后，液體仍渾濁，則在24h時再加第2次蛋白酶K，36h時液體清亮。不同蛋白酶K作用時間下總RNA（含 miRNA）質(zhì)量分別為，1h:1 365.87ng／μL；12h:1 855.56ng／μL；24h:2 045.65ng／μL；36h:2 746.87ng／μL；48h:2 718.56ng／μL。以上5組總 RNA 均能檢測出相關(guān)miRNA的表達。但1、12及24h之Cq值明顯高于36h及48h，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖2。

圖1 FFPE組織不同厚度切片與miRNA表達的關(guān)系

圖2 HCC蛋白酶K作用時間與miRNA表達的關(guān)系

2.4 組織量與miRNA表達的關(guān)系 如一次提取的組織量過多，有可能導(dǎo)致各個步驟的離心管阻塞，從而影響提取質(zhì)量和數(shù)量。本實驗也選取3例HCC組織，進行不同組織量（3.0、6.0、12.0、24.0mm3）的對比（圖3），結(jié)果顯示組織總體積為24.0mm3時，RNA量最高，并未發(fā)生離心管阻塞現(xiàn)象。其中病例1不同組織體積提取總RNA數(shù)量分別為900.24、1 800.45、2 799.34、4 935.45ng／μL，病 例 2 為 687.45、1 356.45、2 436.34、4 535.45ng／μL，病 例 3 為 865.42、1 564.72、2 987.12、5 432.56ng／μL。各組RNA也經(jīng)實時熒光定量RT－PCR檢測，各miRNA表達量未見明顯差別。

圖3 蛋白酶K作用時間與miRNA表達的關(guān)系

2.5 新鮮細胞及石蠟組織miRNA表達的對比 抽提HepG2、HepB3、SNU449及SNU398 4種肝癌細胞系新鮮細胞及石蠟組織的總RNA，實時熒光定量RT－PCR檢測各miRNA表達量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），HepB3、SNU449及SNU398結(jié)果未示，見圖4。

圖4 HepG2同一細胞系新鮮細胞及石蠟組織miRNA表達的對比

3 討 論

石蠟組織中RNA降解或修飾嚴重，但是miRNA因為本身體積較小，大部分石蠟組織中的miRNA未被修飾，保存完整，為利用石蠟組織資源研究miRNA的在各種疾病中的作用機制提供了基礎(chǔ)［12］。miRNeasy FFPE試劑盒能提取純化長度18個核苷酸以上的總RNA，獨特的裂解和孵育條件逆轉(zhuǎn)甲醛對RNA造成的修飾。并且裂解緩沖液可將RNA從組織切片中有效釋放出來，同時避免進一步的RNA降解。該試劑盒使用gDNA去除柱有效去除基因組DNA污染。但在組織脫蠟的過程中，如果缺少完整細胞膜的保護，二甲苯或無水乙醇可溶解部分miRNA，造成miRNA的丟失。成人肝細胞直徑為20～30μm，故過薄的切片細胞膜的完整性受到破壞，直接影響miRNA提取的數(shù)量與質(zhì)量。本實驗將試劑盒推薦的5～10μm切片厚度增加至20、30、40μm，結(jié)果發(fā)現(xiàn)30μm厚度保持完整的miRNA效果最佳。

蛋白酶K是一種切割活性較廣的絲氨酸蛋白酶。它切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽鍵，用于生物樣品中蛋白質(zhì)的一般降解。在RNA提取中，蛋白酶K的作用還有降解RNA酶，防止RNA的降解。本研究發(fā)現(xiàn)，蛋白酶K作用時間對miRNA數(shù)量及質(zhì)量有著重要的影響，最佳作用時間應(yīng)為肉眼觀標本液體呈現(xiàn)清亮后再延長12h。在蛋白酶K作用期間，可多次劇烈振蕩，協(xié)助樣品中蛋白質(zhì)的降解。

綜上所述，經(jīng)改良后的miRNA抽提方法穩(wěn)定，可重復(fù)性強，提取的含miRNA的總RNA純度高，產(chǎn)量高，多個miRNA表達量與從新鮮細胞提取的miRNA對比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。同時保存15年以上的FFPE組織也可以提取出高質(zhì)量的含miRNA的總RNA。故經(jīng)過條件優(yōu)化的從FFPE組織提取miRNA的方法值得推廣使用。

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Optimization of MicroRNA extraction method from HCC FFPE tissues＊

Dang Yiwu1，Rong Minhua2，Chen Gang1△
（1.Department of Pathology，the First Affiliated Hospital of Guangxi Medical University，Nanning，Guangxi 530021，China；2.Department of Research，Affiliated Cancer Hospital，Guangxi Medical University，Nanning Guangxi 530021，China）

ObjectiveTo modify and optimize the microRNA（miRNA）extraction and detection approach from hepatocellular carcinoma（HCC）formalin fixed paraffin embedded（FFPE）tissues.MethodsmiRNeasy FFPE kit was performed to investigate the optimizational thickness of sections from HCC FFPE tissues and time of protease K treatment.Afterwards，expression of miR－221，miR－146a，let7－a，miR－191，miR－103and RNU6Bwas detected by real time RT－PCR.The difference of the miRNA expression between fresh cells and FFPE tissues from the same cell line was also compared by real time RT－PCR.Results30μm thickness and 48hof proteinase K treatment were the best parameters to isolate miRNA.Different expression levels of all the miRNAs could be detected in both the HCC cells samples and clinic FFPE samples.There was no significant variation of the miRNA expression between fresh cells and FFPE samples from the same cell lines.ConclusionThe optimizational miRNeasy FFPE method is applicable for miRNA extraction from FFPE tissues.The method is productive and can be popularized for the miRNA isolation for different FFPE tissues.

microRNAs；formaldehyde；paraffin embedding；liver neoplasms；reverse transcriptase polymerase chain reaction

10.3969／j.issn.1671－8348.2012.34.020

A

1671－8348（2012）34－3623－03

廣西自然科學基金資助項目（2010GXNSFB013059）。 △

，Tel:（0771）5356534；E－mail:chen＿gang＿triones＠163.com。

2012－06－13

2012－09－12）

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