林海泓 羅心平 施海明 龔輝

（1.復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院心內(nèi)科，上海 201508；2.復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院心內(nèi)科，上海 200040）

骨髓間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）移植為治療心肌梗死提供了新思路，但是MSCs移植后的存活率低，使得歸巢到損傷心肌的干細胞數(shù)量甚少，這極大地影響了MSCs移植的臨床應(yīng)用效果[1]。

他汀類藥物除具有降脂作用外，還具有促血管生成、改善內(nèi)皮功能障礙、抗氧化、抗炎等作用。近年來人們逐漸開始關(guān)注他汀類藥物與干細胞的關(guān)系。文獻[2－3]報告，他汀類藥物可增加外周血內(nèi)皮祖細胞數(shù)量，延緩其衰老，從而加快受損血管內(nèi)皮的修復(fù)，這可能是他汀類藥物心臟保護作用的機制之一，據(jù)此推測其對MSCs也可能有類似作用。本研究旨在探討普伐他汀在體外對H2O2誘導(dǎo)的人MSCs凋亡的影響及其相關(guān)機制。

1 資料與方法

1.1 主要試劑 低糖DMEM及胎牛血清購自美國 HyClone公司，0.25%胰酶和0.02%EDTA液購自美國Sigma公司，淋巴細胞分離液購自上海華精生物高科技有限公司，普伐他汀購自中美上海施貴寶制藥公司，細胞及組織總蛋白抽提試劑盒、BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒及二抗購自上?？党缮锕こ坦?，PI3K／Akt通路特異抑制劑Ly294002、ERK1／2通路特異抑制劑U0126、一抗AKT抗體、ERK1／2抗體及p38MAPK抗體購自美國Cell Signaling公司，p38MAPK通路特異激動劑anisomycin購自美國Santa Cruz公司。

1.2 人MSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定 嚴格無菌條件下采集志愿者骨髓液5 mL，肝素抗凝，用孔徑為0.02 mm的輸血器過濾3次，加等量磷酸鹽緩沖液（PBS）混勻后，用1 mL針頭沿管壁慢慢注入淋巴細胞分離液，2000 r／min離心20 min。輕輕吸出中間白色云霧狀細胞層，加入PBS洗滌細胞，1000 r／min離心5 min，共洗3次。加入完全培養(yǎng)基后混勻，置于37℃5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。胰酶消化，1∶2傳代。取第6代細胞用流式細胞儀進行細胞表型檢測。

1.3 實驗分組 將傳代后第4天的第6代MSCs用含0.5%血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h后，隨機分為5組。普伐他汀組換用含10μmol／L普伐他汀的完全培養(yǎng)基；對照組則始終用完全培養(yǎng)基；另3組分別用20μmol／L的Ly294002、20μmol／L的U0126以及10 mg／L的anisomycin預(yù)處理1 h后，換用含普伐他汀10μmol／L的完全培養(yǎng)基。1 h后所有組均用含1 mmol／L的H2O2的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。12 h后在顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。

1.4 膜聯(lián)蛋白V／PI雙染流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 各組細胞經(jīng)PBS洗滌后，消化并重懸為細胞懸液，收集于10 mL的離心管中，每樣本細胞數(shù)為（1～5）×106／mL，離心、洗滌細胞后用100μL的標記溶液重懸細胞，室溫下避光孵育10～15 min。再次離心、洗滌，加入熒光（SA-FLOUS）溶液4℃孵育20 min后，用流式細胞儀（Becton Dickinson公司）檢測。

1.5 細胞蛋白提取及 Western blotting檢測 按常規(guī)方法進行。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理 用Stata 7.0軟件包進行統(tǒng)計學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差（）表示，兩組間比較用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 人MSCs細胞鑒定 用流式細胞儀對培養(yǎng)第6代的人MSCs進行細胞表型分析顯示，細胞CD34表達 （－），CD105（＋）、CD106（＋）。

2.2 普伐他汀對 MSCs中PI3K／Akt、ERK1／2及p38MAPK通路的影響 普伐他汀可使人MSCs的PI3K／Akt通路磷酸化水平升高，2 h后作用仍持續(xù)；也可抑制p38MAPK通路磷酸化水平，抑制作用于30 min時達高峰。但是普伐他汀對人MSCs的ERK1／2通路和總Akt、總p38MAPK水平無顯著影響，見圖1～3。

2.3 人MSCs經(jīng)H2O2誘導(dǎo)凋亡后的形態(tài)檢測 未經(jīng)H2O2作用的MSCs貼壁生長良好，邊界清楚，排列緊密，成纖維樣生長，見圖4。細胞經(jīng)1 mmol／L H2O2作用12 h后，細胞間隙增寬，細胞體積縮小，細胞內(nèi)顆粒及空泡增多，出現(xiàn)較多懸浮死亡細胞，有的細胞崩解為碎片，見圖5。經(jīng)普伐他汀預(yù)處理后再經(jīng)1 mmol／L H2O2處理的細胞，形態(tài)變化顯著輕于對照組，細胞形態(tài)基本保持不變，但細胞內(nèi)空泡較多，見圖6。普伐他汀＋Ly294002組細胞形態(tài)與對照組無顯著差異，見圖7。

2.4 流式細胞儀檢測人MSCs經(jīng)H2O2誘導(dǎo)后的凋亡情況 普伐他汀組和普伐他?。玜nisomycin組均能對H2O2誘導(dǎo)的人MSCs凋亡起到顯著保護作用（P＜0.05），但普伐他汀＋Ly294002組無此保護作用，提示普伐他汀對人MSCs的凋亡保護作用可能與PI3K／Akt信號傳導(dǎo)通路有關(guān)。見表1。

表1 藥物作用后對H2O2誘導(dǎo)的人MSCs凋亡的影響

3 討 論

研究[4]顯示，心肌梗死后行干細胞移植不論采取何種途徑，移植后的細胞僅有少量能最終到達心肌損傷部位并存活生長，而大部分移植細胞在肺、肝等器官中被發(fā)現(xiàn)。另有研究[5]顯示，如果在急性心肌梗死后過早進行干細胞移植，大部分移植細胞可能不能在缺血后的惡劣微環(huán)境中存活。因此，當前干細胞移植面臨的一個重大挑戰(zhàn)就是如何保護移植細胞、改善細胞的存活率并促進移植細胞在受損心肌組織內(nèi)分化生長，以提高細胞移植效率。

本研究對體外培養(yǎng)的第6代人MSCs進行細胞表型分析，發(fā)現(xiàn) CD34 （-），而 CD105（＋），CD106（＋），這符合MSCs表型特征。細胞對于外界刺激的反應(yīng)是通過信號之間的相互作用和交流進行的，沒有任何一條通路在細胞的某種反應(yīng)中獨立存在，每條通路都和許多其他途徑相整合，它們的相互作用、整合的強度決定了細胞的命運。

本研究發(fā)現(xiàn)，PI3K／Akt通路的磷酸化水平在普伐他汀刺激后15 min即可升高，至2 h時作用仍持續(xù)；p38MAPK通路磷酸化水平則在普伐他汀刺激后受到抑制，抑制作用于30 min時達高峰，隨后減弱。這說明普伐他汀可激活人MSCs的PI3K／Akt通路并抑制p38MAPK通路。由于本研究結(jié)果顯示普伐他汀對人MSCs的ERK1／2通路無顯著影響，故其后未進行與此通路相關(guān)的凋亡實驗。

移植到缺血的部位后大部分細胞可能因無法耐受缺血環(huán)境而發(fā)生凋亡，因此減少細胞凋亡可能會提高移植效率。文獻[6]報告，他汀類藥物具有抗細胞凋亡作用，能夠保護多種細胞免受各種刺激誘導(dǎo)的凋亡。那么它對人MSCs的凋亡是否同樣具有保護作用？本研究顯示，普伐他汀可顯著地減輕細胞凋亡程度。而且我們發(fā)現(xiàn)，激活p38MAPK途徑后并不能影響藥物對H2O2誘導(dǎo)人MSCs凋亡的拮抗效應(yīng)。這一結(jié)果表明，p38MAPK途徑與普伐他汀介導(dǎo)的抗凋亡作用無關(guān)。當用特異的PI3K／Akt通路抑制劑Ly294002阻斷PI3K／AKT信號途徑時，普伐他汀對人MSCs的保護作用受到抑制，提示PI3K／Akt通路的激活在普伐他汀對H2O2誘導(dǎo)人MSCs凋亡的抑制作用中起重要的調(diào)控作用。

本研究結(jié)果表明，普伐他汀對H2O2誘導(dǎo)的人MSCs凋亡有抑制作用。PI3K／Akt通路的激活參與了這種抗凋亡作用的調(diào)控。所以，普伐他汀在保護移植干細胞、改善干細胞的存活率并促進移植干細胞在受損心肌組織內(nèi)生長、提高干細胞移植效率等方面具有一定價值。

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