長(zhǎng)囊水云葉綠體基因組密碼子使用特征分析

劉福利，王飛久，邵展茹

（1.農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島100049，2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 黃海水產(chǎn)研究所，山東 青島，100049；3.中國(guó)科學(xué)院 海洋研究所，山東 青島，266071）

遺傳密碼是聯(lián)系基因核苷酸序列與蛋白質(zhì)氨基酸序列的紐帶，具有簡(jiǎn)并性特點(diǎn)，即多個(gè)同義密碼子編碼同一種氨基酸。如果沒(méi)有任何選擇壓力和突變基因的偏倚，每個(gè)核苷酸位點(diǎn)上的核苷酸突變都是隨機(jī)的，同義密碼子出現(xiàn)的概率也是一樣的。但研究表明，同義密碼子非均衡使用的現(xiàn)象普遍存在，即某些密碼子比其他同義密碼子具有更高的使用頻率，這些密碼子被稱(chēng)為最優(yōu)密碼子，此現(xiàn)象稱(chēng)為密碼子偏性。這種同義密碼子使用的偏好性廣泛存在于從原核到真核生物中，從單一物種基因組中的不同基因到不同物種的基因組中［1－2］。研究發(fā)現(xiàn)，影響密碼子偏好性的因素有很多，如堿基組成的差異［3－4］、自然選擇（體現(xiàn)在基因表達(dá)水平上）［5－6］、tRNA 豐度［7－9］、基因長(zhǎng)度［10－11］、mRNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)［12］、蛋白結(jié)構(gòu)、疏水性以及氨基酸保守性［13］等。研究基因組和基因的密碼子使用特征，具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。

長(zhǎng)囊水云（Ectocarpussiliculosus）隸屬于褐藻門(mén)（Phaeophyta）褐子綱（Phaeosporeae）水云目（Ectocarpales）水云科（Ectocarpaceae）水云屬（Ectocarpus）。藻體為異絲體，由單列細(xì)胞組成并分枝。生于潮間帶巖石上或石沼中，或附生于其他藻體上。由于具有以下特征，長(zhǎng)囊水云被法國(guó)科學(xué)家Peter等推薦為褐藻類(lèi)研究的模式生物［14］：較小的藻體（數(shù)厘米）；較短的生活史，實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下3個(gè)月內(nèi)可完成其生活史；易于進(jìn)行遺傳分析；可進(jìn)行大規(guī)模的突變體篩選；繁殖力強(qiáng)；可被一種DNA病毒感染（可提供一種潛在的插入突變工具）；具有較小的基因組。2004－09長(zhǎng)囊水云基因組計(jì)劃在法國(guó)的羅斯科夫海洋研究站（Station Biologigue de Roscoff）啟動(dòng)。在該計(jì)劃的推動(dòng)下，長(zhǎng)囊水云的相關(guān)研究尤其是分子生物學(xué)領(lǐng)域蓬勃發(fā)展，其葉綠體基因和核基因組分別于2009年和2010年完成了全序列測(cè)定［15－16］。另外，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中存儲(chǔ)有67 106條長(zhǎng)囊水云的EST序列。這些工作為長(zhǎng)囊水云以及以長(zhǎng)囊水云為模式生物的褐藻的研究奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。為研究長(zhǎng)囊水云葉綠體基因組的遺傳及變異，闡明葉綠體基因組與核基因組的關(guān)系，進(jìn)一步探討長(zhǎng)囊水云葉綠體的進(jìn)化，本研究以長(zhǎng)囊水云葉綠體全基因組序列為基礎(chǔ)，對(duì)其密碼子使用特征進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 序列數(shù)據(jù)

長(zhǎng)囊水云（E.siliculosus）葉綠體基因組序列（序列號(hào)：FP102296）從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)下載。長(zhǎng)囊水云的葉綠體DNA為雙鏈環(huán)狀，序列全長(zhǎng)為139 954bp，基因組平均G＋C含量約為30%。根據(jù)基因組序列的注釋信息，占全基因組72%的編碼序列中共有185個(gè)編碼基因，其中148個(gè)蛋白編碼基因，37個(gè)RNA編碼基因。為減少長(zhǎng)度較短基因變異所帶來(lái)的樣本誤差，依照國(guó)際通用辦法，去除59個(gè)長(zhǎng)度小于350bp的基因［17］，提取剩余的89個(gè)蛋白編碼基因的Coding Sequence（CDS）序列，分析長(zhǎng)囊水云葉綠體基因組密碼子的使用特征。

1.2 同義密碼子使用偏好性分析

相對(duì)同義密碼子使用度（Relative Synonymous Codon Usage，RSCU），用來(lái)檢測(cè)基因中全部密碼子使用的變化，它等于同義密碼子的實(shí)際觀測(cè)值與同義密碼子平均使用時(shí)期望值的比值。對(duì)于同義密碼子家族中的密碼子來(lái)說(shuō)，如果這個(gè)同義密碼子的RSCU＞1，則表明該密碼子的使用頻率高于期望值，反之亦然［5］。我們使用在線分析軟件Codonw（http：∥codonw.sourceforge.net／）進(jìn)行RSCU的計(jì)算。

有效密碼子數(shù)（Effective Number of Codon，ENC），描述密碼子使用偏離隨機(jī)選擇的程度，能反映密碼子家族中同義密碼子非均衡使用的偏好程度［18］。使用歐洲分子生物學(xué)開(kāi)放軟件系統(tǒng)（European Molecular Biology Open Software Suite，EMBOSS）的CHIPS軟件來(lái)計(jì)算ENC。

堿基組成也是衡量同義密碼子使用偏好性的指標(biāo)，應(yīng)用EMBOSS中的CUSP計(jì)算GC含量及GC在密碼子第1～第3位上的含量（GC1，GC2，GC3）。為了檢測(cè)密碼子使用偏好性是否受到基因組堿基組成的影響，繪制了Nc－plot曲線。若一個(gè)基因的密碼子使用模式受到GC堿基組成影響的話，則這個(gè)基因?qū)⒙湓贓Nc－plot期望曲線的上面或接近曲線的位置，否則該基因?qū)⒙湓陔x期望曲線比較遠(yuǎn)的位置［18］。

密碼子適應(yīng)指數(shù)（Codon Adaptation Index，CAI）常用于基因表達(dá)水平的測(cè)量。此值為0～1，越接近1則表示基因的表達(dá)水平越高［1］。以長(zhǎng)囊水云葉綠體中25個(gè)高表達(dá)的核糖體蛋白基因的相對(duì)密碼子使用度RSCU和密碼子相對(duì)適應(yīng)值w（Relative Adaptiveness of Codon）作為計(jì)算CAI值的參考數(shù)據(jù)，用軟件Codonw計(jì)算各基因的CAI。

1.3 最優(yōu)密碼子的確定

高表達(dá)優(yōu)越密碼子（High－expression Codon，HE）和高頻密碼子（High－frequency Codon，HF）的確定分別參見(jiàn)文獻(xiàn)［11］和［19］。研究中將同時(shí)確定為高表達(dá)優(yōu)越密碼子和高頻密碼子的同義密碼子定義為長(zhǎng)囊水云葉綠體基因組的最優(yōu)密碼子。

2 結(jié) 果

2.1 同義密碼子使用偏性分析

為從整體上研究長(zhǎng)囊水云葉綠體基因組的密碼子使用特征，將CDS長(zhǎng)度大于350bp的89個(gè)蛋白編碼基因整合為一條長(zhǎng)度為88 671bp的序列，該序列占基因組總序列的63.4%，共有29 468個(gè)有義密碼子，其中28 565為同義密碼子，將該序列作為長(zhǎng)囊水云葉綠體基因組的代表來(lái)研究其密碼子使用特征。

長(zhǎng)囊水云葉綠體基因組中，GC1，GC2，GC3和GC分別為43.3%，34.8%，17.32%和31.8%，每個(gè)值都較低，由此可見(jiàn)基因整體GC含量較低。從密碼子不同位置的堿基組成來(lái)看，位于密碼子中3個(gè)位置的GC含量并非平均分布，其分布規(guī)律是GC1＞GC2＞GC3，且3個(gè)位置GC含量的差值較大，尤其是密碼子第3位的GC3含量很低僅為17.32%。由此可知，以A或T堿基結(jié)尾的密碼子在長(zhǎng)囊水云葉綠體基因中的使用頻率高于以G或C堿基結(jié)尾的密碼子。

ENC是衡量同義密碼子使用偏性的一個(gè)重要指標(biāo)，其取值范圍在20～61，即如果每種氨基酸只使用1種密碼子則有效密碼子數(shù)為20，如果各種同義密碼子的使用機(jī)會(huì)完全均等，則有效密碼子數(shù)為61，即該值越靠近20則偏性越強(qiáng)。長(zhǎng)囊水云葉綠體基因組的ENC值為39，此值較小。另外，89個(gè)基因的ENC值介于31～52，總體上ENC值都較小，這表明長(zhǎng)囊水云葉綠體基因組的密碼子使用偏離隨機(jī)選擇，反映出長(zhǎng)囊水云葉綠體基因組的同義密碼子具有較強(qiáng)的使用偏性。

以長(zhǎng)囊水云葉綠體25個(gè)高表達(dá)的核糖體蛋白基因的相對(duì)密碼子使用度RSCU和密碼子相對(duì)適應(yīng)值w作為參考數(shù)據(jù)，來(lái)計(jì)算長(zhǎng)囊水云葉綠體基因組及各個(gè)基因的CAI。長(zhǎng)囊水云葉綠體基因組的CAI值為0.638，89個(gè)基因的CAI值變化范圍為0.51～0.74?？傮w上CAI值都較大，表明長(zhǎng)囊水云葉綠體基因組的同義密碼子具有較強(qiáng)使用偏性。

表1 長(zhǎng)囊水云葉綠體基因組密碼子的相對(duì)使用度Table 1 RSCU in the chloroplast genome of E.siliculosus

2.2 同義密碼子的相對(duì)使用度

同義密碼子的相對(duì)使用度（RSCU）為某一密碼子所使用的頻率與其在無(wú)偏使用時(shí)預(yù)期頻率之間的比值，它去除了氨基酸組成對(duì)密碼子使用的影響，且直觀地反映了密碼子使用的偏好性。表2顯示了葉綠體基因各密碼子的使用頻次和相對(duì)使用度。密碼子UUU，UUA，AUU等27個(gè)密碼子的RSCU＞1，表明這些密碼子是葉綠體基因偏好的密碼子。這些偏好密碼子均以A或U堿基結(jié)尾。而以G或C堿基結(jié)尾的密碼子的使用情況則剛好相反，它們出現(xiàn)次數(shù)少、RSCU＜1，是長(zhǎng)囊水云葉綠體基因少量使用或避免使用的密碼子。葉綠體基因在終止密碼子的使用上偏好UAA。

表2 長(zhǎng)囊水云葉綠體基因組的最優(yōu)密碼子Table 2 The optimal codons in the chloroplast genome of E.siliculosus

2.3 最優(yōu)密碼子的確定

計(jì)算長(zhǎng)囊水云葉綠體基因組89個(gè)基因的CAI，并按其大小對(duì)基因進(jìn)行排列，從這一排列的兩端各取基因樣本總數(shù)的5%，分別組成高、低表達(dá)樣本組。根據(jù)Duret［11］對(duì)最優(yōu)密碼子的定義，確定了UUU，UUG和GUU等25個(gè)密碼子為高表達(dá)優(yōu)越密碼子。根據(jù)林濤等［19］方法同樣也確定了UUU，UUA和GUU等25個(gè)密碼子為高頻密碼子。若將兩者綜合評(píng)定，UUU，GUU，UCA等12個(gè)密碼子被確定是長(zhǎng)囊水云葉綠體基因組的最優(yōu)密碼子（表3）。

2.4 同義密碼子使用偏性影響因素分析

長(zhǎng)囊水云葉綠體基因組的89個(gè)基因的ENC值在31～52變動(dòng)，平均值為39。GC3值的變化范圍為7.9%～23.8%，平均值為14.6%。相關(guān)性分析結(jié)果顯示二者不具相關(guān)性。另外，Nc－plot曲線顯示（圖1），少量偏性較弱（ENC值較大）的基因落在期望線上方，說(shuō)明這些基因密碼子的使用偏性受到堿基組成的影響；而大部分基因落在期望曲線下面，尤其是一些密碼子使用偏性較強(qiáng)（ENC值較?。┑幕蚵湓诰嗥谕€比較遠(yuǎn)的位置，表明堿基組成不是影響密碼子使用偏性的主要因素。這可能與長(zhǎng)囊水云葉綠體基因組的GC含量，尤其是GC3含量較低，導(dǎo)致葉綠體基因組的GC異質(zhì)性較差有關(guān)。

圖1 長(zhǎng)囊水云葉綠體基因組的Nc曲線圖Fig.1 Nc－plot curve of the chloroplast genome of Ectocarpus siliculosus

CAI和ENC相關(guān)性分析結(jié)果顯示二者顯著負(fù)相關(guān)（r＝－0.397，p＜0.01），表明基因表達(dá)水平顯著影響基因的密碼子使用偏性，高表達(dá)的基因具有更強(qiáng)的密碼子使用偏性，例如葉綠體中高表達(dá)的psbA1和rbcS基因，它們的具有較強(qiáng)的密碼子使用偏性（ENC值分別為30.85和34.47）。另外，ENC與基因長(zhǎng)度不具相關(guān)性，表明長(zhǎng)囊水云葉綠體基因的長(zhǎng)度可能不會(huì)影響密碼子的使用偏性。

3 討 論

本研究通過(guò)計(jì)算長(zhǎng)囊水云葉綠體蛋白編碼基因的多個(gè)密碼子使用偏性指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)囊水云葉綠體基因組存在較強(qiáng)的密碼子使用偏性，偏好使用以A或T堿基結(jié)尾的密碼子。這與水稻、楊樹(shù)和玉米等植物葉綠體基因的密碼子用法偏好性分析結(jié)果一致，表明這些植物葉綠體基因具有相似的密碼子使用規(guī)律。

影響密碼子使用的因素眾多，不同物種或同一物種的不同基因的密碼子使用偏好性的原因也不盡相同。Sharp等認(rèn)為在高效表達(dá)基因中，密碼子的使用偏性由翻譯的選擇壓主宰；而在低表達(dá)基因或群體比較小的物種中，主要通過(guò)突變或漂移產(chǎn)生，選擇作用相對(duì)較弱［5］。Morton認(rèn)為，在地錢(qián)、水稻和煙草的葉綠體基因組中堿基組成是造成同密碼子使用偏性的主要因素，但是在個(gè)別高表達(dá)的基因中（例如psbA），選擇造成了密碼子使用偏性［20］。Morton認(rèn)為DNA鏈的不對(duì)稱(chēng)突變也是造成Euglenagracilis使用偏性的主要原因［21］。另外，劉慶坡認(rèn)為基因表達(dá)水平和基因堿基組成是影響水稻葉綠體密碼子使用的主要因素［22］；Zhou等認(rèn)為基因組的堿基突變偏好性是影響擬南芥、楊樹(shù)等種子植物的葉綠體基因密碼子使用的主要因素［23］；劉漢梅認(rèn)為玉米葉綠體基因組的堿基組成是影響密碼子使用偏性的主要因素［24］。本研究中發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)囊水云葉綠體基因組的密碼子使用受到表達(dá)水平上的自然選擇以及基因堿基組成的突變影響，其中選擇作用對(duì)高表達(dá)基因的密碼子使用的影響比較突出，而突變是低表達(dá)基因密碼子使用偏性的主要影響因素。

Sugiura等報(bào)道在煙草葉綠體基因組中，有3個(gè)基因（rps19，psbC和ycf15）以GTG為起始密碼子，2個(gè)基因（psbL和ndhD）以ACG為翻譯起始密碼子［25］。劉慶坡等報(bào)道在粳稻葉綠體基因組也有與煙草類(lèi)似的情況［23］。本研究中發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)囊水云葉綠體基因組148個(gè)蛋白編碼基因中，絕大部分基因以ATG作為起始密碼子，但有3個(gè)基因（rpl3，rps8和rbcR）以GTG為起始密碼子，另外基因Escp99以TTG為起始密碼子。密碼子GTG和TTG是少數(shù)原核生物（例如某些細(xì)菌）的起始密碼子，這從起始密碼子使用的角度上，證明長(zhǎng)囊水云葉綠體與原核生物具有一定的相似性，這可以作為關(guān)于葉綠體進(jìn)化的內(nèi)吞假說(shuō)的佐證。

研究確定某物種的基因組或基因的最優(yōu)密碼子，具有多方面的意義，例如根據(jù)最優(yōu)密碼子可以預(yù)測(cè)基因的表達(dá)量，可以對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化以提高其在宿主中的表達(dá)量，還可以發(fā)現(xiàn)新基因并對(duì)其功能進(jìn)行預(yù)測(cè)。不同的研究者對(duì)最優(yōu)密碼子的定義并不統(tǒng)一。最優(yōu)密碼子最初定義為在高表達(dá)基因中出現(xiàn)頻率比低表達(dá)基因中出現(xiàn)頻率高的同義密碼子［7］。后來(lái)Sharp等認(rèn)為從低密碼子使用偏性的基因到高密碼子使用偏性的基因，那些使用頻率在統(tǒng)計(jì)上顯著增加的同義密碼子為最優(yōu)密碼子［6］。Duret等將那些出現(xiàn)頻率隨基因表達(dá)水平升高而增加的密碼子定義為高表達(dá)優(yōu)越密碼子［11］。林濤等的高頻密碼子分析法未將高表達(dá)與低表達(dá)蛋白基因分開(kāi)，認(rèn)為相對(duì)同義密碼子使用頻率大于60% 或超過(guò)該組同義密碼子平均占有頻率的1.5倍的即為高頻密碼子［20］。本研究應(yīng)用這2種方法分別確定了25個(gè)最優(yōu)密碼子，我們把二者共同確定的12個(gè)密碼子確定為長(zhǎng)囊水云葉綠體基因組的最優(yōu)密碼子。

4 結(jié) 語(yǔ)

我們研究長(zhǎng)囊水云葉綠體基因組的密碼子使用特征，通過(guò)計(jì)算、分析密碼子使用偏性的多個(gè)參數(shù)，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)囊水云葉綠體基因組的密碼子存在較強(qiáng)的使用偏性，偏向使用A或T堿基結(jié)尾的密碼子。長(zhǎng)囊水云葉綠體基因組密碼子的使用偏性受到了基因表達(dá)水平上的自然選擇以及基因堿基組成中性突變的雙重影響，其中選擇的作用對(duì)高表達(dá)基因密碼子使用偏性的影響比較突出，而突變是低表達(dá)基因密碼子使用偏性的主要影響因素。另外，首次確定了UUU，GUU，UCA等12個(gè)密碼子為長(zhǎng)囊水云葉綠體基因組的最優(yōu)密碼子。這些結(jié)果對(duì)研究長(zhǎng)囊水云葉綠體基因組相關(guān)特性的遺傳及變異，闡明葉綠體基因組與核基因組的關(guān)系，以及探討長(zhǎng)囊水云葉綠體的進(jìn)化等問(wèn)題均有重要的理論意義，也對(duì)預(yù)測(cè)長(zhǎng)囊水葉綠體基因組編碼基因的表達(dá)量及優(yōu)化其基因體外表達(dá)等問(wèn)題均具應(yīng)用價(jià)值。

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