耐亞安培南的銅綠假單胞菌OprD2的缺失與金屬β－內(nèi)酰胺酶編碼基因的研究

郝維敏

（宿州市立醫(yī)院 檢驗(yàn)科，安徽 宿州234000）

銅綠假單胞菌是醫(yī)院感染的常見(jiàn)致病菌，免疫力低下的患者可引起嚴(yán)重的呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎、敗血癥、燒傷創(chuàng)面和泌尿系統(tǒng)感染等，在臨床抗感染治療中，容易對(duì)臨床常用的抗生素產(chǎn)生耐藥，且耐藥機(jī)制復(fù)雜。亞胺培南曾經(jīng)是銅綠假單胞菌治療的有效藥物［1］，但隨著亞胺培南的廣泛應(yīng)用，其敏感性逐年下降。研究表明，亞胺培南進(jìn)入細(xì)菌的通道蛋白OprD2的缺失，染色體介導(dǎo)的頭孢菌素酶的產(chǎn)生，非特異性藥物的主動(dòng)外排系統(tǒng)和產(chǎn)金屬β－內(nèi)酰胺酶都可以導(dǎo)致銅綠假單胞菌對(duì)亞胺培南的耐藥［2，3］。為了解本院耐亞胺培南的銅綠假單胞菌中外膜蛋白OprD2的缺失及產(chǎn)金屬β－內(nèi)酰胺酶（MBLs）菌株編碼基因的攜帶情況，我們收集了本院2009年1月—2010年1月所有耐亞胺培南的銅綠假單胞菌的臨床分離株，并對(duì)這些菌株的OprD2的缺失及產(chǎn)金屬β－內(nèi)酰胺酶菌株的編碼基因進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 菌株來(lái)源 收集本院2009年1月—2010年4月臨床分離的耐亞胺培南的銅綠假單胞菌76株，所有重復(fù)菌株均排除在外。76株不重復(fù)菌株分別分離自痰標(biāo)本（58株），傷口分泌物（18株），尿標(biāo)本（4株），血培養(yǎng)（3株），其他標(biāo)本（3株）。76株耐亞胺培南的銅綠假單胞菌分別來(lái)自ICU38株，干部病房15株，外科病區(qū)10株，呼吸科6株，泌尿科4株，感染科3株。標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株為銅綠假單胞菌ATCC27853購(gòu)自衛(wèi)生部臨檢中心，產(chǎn)IMP和VIM型金屬酶的菌株由安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科細(xì)菌室惠贈(zèng)。

1．2 檢測(cè)方法

1．2．1 儀器試劑 法國(guó)梅里埃公司的VITER32全自動(dòng)微生物分析儀，PCR擴(kuò)增儀為美國(guó)PE公司產(chǎn)品，電泳儀為北京六一儀器廠生產(chǎn)，紫外凝膠電泳成像系統(tǒng)由安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供。MH瓊脂和亞胺培南藥敏紙片購(gòu)自O(shè)xoid公司，EDTA購(gòu)自Sigma公司，PCR的Master試劑購(gòu)自上海生物工程公司，引物合成序列由分析由上海生物工程公司合成。

1．2．2 細(xì)菌鑒定及藥敏試驗(yàn) 用VITER32全自動(dòng)微生物分析儀配套的鑒定卡將細(xì)菌鑒到種，瓊脂稀釋法測(cè)定76株耐亞胺培南的銅綠假單胞菌的最低抑菌濃度（MIC），按美國(guó)實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（CLSI）的最新推薦標(biāo)準(zhǔn)判定結(jié)果。

1．2．3 產(chǎn)MBLs菌株篩選 采用亞胺培南－EDTA紙片增效法進(jìn)行檢測(cè)。按照標(biāo)準(zhǔn)紙片擴(kuò)散法藥敏試驗(yàn)操作規(guī)程，在M－H平板上涂抹待檢菌，分別貼2張IMP藥敏紙片，紙片間距為30－40mm，其中一張IMP紙片加EDTA溶液15ml，37℃孵育24小時(shí)，加EDTA紙片抑菌圈直徑比不加EDTA紙片抑菌圈直徑≥7mm為MBLs陽(yáng)性。

1．2．4 PCR耐藥基因的檢測(cè) 擴(kuò)增用模板制備采用煮沸法。反應(yīng)總體積為50μl。檢測(cè)OprD2的基因 （F 5′－GGAATAGAGTGGCTTAATTCTC，R 5′－GCCACGCGATTTGACGGAG 193bp），IMP型基因（F 5′－TTTCATAGCGACAGCACG，R 5′－TGCGTCTCCAACTTCACTG 378bp）、VIM 型（F 5′－TCCGACAGTCAGCGAAAT， R 5′－GCAGCACCAGGATAGAAGA 435bp）、金屬β－內(nèi)酰胺酶的引物由上海生工公司合成。

檢測(cè)OprD2基因的反應(yīng)條件為93℃3min預(yù)變性，93℃1min、55℃1min，72℃1min循環(huán)35次，最后，72℃5min充分延伸。檢測(cè)MBLs各基因的反應(yīng)條件為：先94℃4min預(yù)變性，然后94℃1min、55℃1min、72℃1．5min循環(huán)25次，最后72℃10 min充分延伸。PCR產(chǎn)物經(jīng)0．8%瓊脂糖凝膠電泳后觀察結(jié)果。

1．2．5 數(shù)據(jù)分析 用 WHONET5．3軟件對(duì)細(xì)菌的MIC結(jié)果進(jìn)行耐藥性分析。

2 結(jié)果

2．1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 76株耐亞胺培南的銅綠假單胞菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 76株耐亞胺培南的銅綠假單胞菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2．2 OprD2基因的檢測(cè)結(jié)果 經(jīng)PCR擴(kuò)增OprD2基因發(fā)現(xiàn)：76株耐亞胺培南的銅綠假單胞菌中19株（25%）表達(dá)OprD2的基因，其余57株（75%）OprD2基因缺失，見(jiàn)圖1。

2．3 MBLs及其基因檢測(cè)結(jié)果 本次實(shí)驗(yàn)收集的76株耐亞胺培南的銅綠假單胞菌經(jīng)亞胺培南—EDTA紙片增效試驗(yàn)檢出16（21．1%）株產(chǎn) MBLs，經(jīng)過(guò)基因擴(kuò)增試驗(yàn)證實(shí)，其中13株攜帶VIM型基因，另3株攜帶IMP型基因，VIM、IMP陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)上海生工公司測(cè)序后，證實(shí)分別為 VIM－2和IMP－1型 MBLs．（見(jiàn)圖2、3）。16株產(chǎn) MBLs的菌株都存在孔蛋白通道OprD2的缺失。

圖1 OprD2膜孔蛋白基因檢測(cè)結(jié)果

3 討論

本研究選用的76株銅綠假單胞菌除對(duì)亞胺培南耐藥外，對(duì)其它抗生素均有較高的耐藥性，其中氨曲南耐藥率達(dá)73．7%，環(huán)丙沙星達(dá)53．9%，慶大霉素達(dá)94．7%，頭孢他啶達(dá)43．4%。

圖2 MBLs陽(yáng)性結(jié)果

目前有關(guān)耐亞胺培南的銅綠假單胞菌的耐藥機(jī)制主要涉及到高產(chǎn)AmpC酶、金屬β－內(nèi)酰胺酶的水解、藥物的主動(dòng)排除和外膜蛋白OprD2的減少或缺失［4］。通常外膜蛋白OprD2基因缺乏是介導(dǎo)銅綠假單胞菌對(duì)亞胺培南耐藥的主要機(jī)制［5］，因?yàn)閬啺放嗄鲜欠肿恿枯^小的親水性β－內(nèi)酰胺類藥物，可以通過(guò)細(xì)菌外膜上具有通透性功能的外膜蛋白OprC、OprD2、OprE擴(kuò)散，但OprD2是亞胺培南通過(guò)的特異性通道［6］，本院76株分離的耐亞胺培南的銅綠假單胞菌中，OprD2基因缺失51株，缺失率達(dá)75%，表明外膜蛋白中OprD2的表達(dá)缺乏在我院臨床分離的耐亞胺培南的銅綠假單胞菌中存在，是主要的耐藥機(jī)制。

金屬β－內(nèi)酰胺酶主要有IMP型和VIM型，近年來(lái)又發(fā)現(xiàn)SPM－1型和GIM－1型等類型，能滅活青霉素類，頭孢菌素類和碳青霉烯類抗生素，但對(duì)氨曲南無(wú)水解活性，可被EDTA等金屬螯合劑抑制，但不被β－內(nèi)酰胺酶抑制劑克拉維酸、舒巴坦和他唑巴坦抑制［7］，所以我院分離的耐亞胺培南的銅綠假單胞菌對(duì)氨芐西林／舒巴坦的耐藥率為100%。我院分離的76株耐亞胺培南的銅綠假單胞菌產(chǎn)MBLs16株，其中 VIM－2型13株，IMP－1型3株，表明我院存在產(chǎn)VIM－2型和IMP－1型MBLs菌株的流行。VIM－2型基因主要存在染色體上［6］，僅少數(shù)存在質(zhì)粒上。而IMP－1基因大多位于質(zhì)粒上，但它們多數(shù)位于Ⅰ類整合子結(jié)構(gòu)中，常同時(shí)攜帶氨基糖苷類耐藥基因，所以成多重耐藥，醫(yī)院環(huán)境中出現(xiàn)的產(chǎn)MBLs的銅綠假單胞菌給臨床治療帶來(lái)極大的困難，同時(shí)也是感染控制部門面臨的一個(gè)嚴(yán)峻的問(wèn)題。產(chǎn)MBLs菌株的準(zhǔn)確檢測(cè)和報(bào)導(dǎo)對(duì)于阻止多重耐藥菌的蔓延起到非常重要的作用。本次分離的16株產(chǎn)MBLs的耐亞胺培南的銅綠假單胞菌，OprD2基因全部缺失，表明臨床分離的耐亞胺培南的銅綠假單胞菌存在多重耐藥機(jī)制。因此，我們建議所有臨床分離的銅綠假單胞菌都應(yīng)常規(guī)進(jìn)行OprD2基因和產(chǎn)MBLs的檢測(cè)，減少碳青霉烯類抗生素的不合理使用，從而防止醫(yī)院內(nèi)耐藥菌的傳播。

［1］王 晶，韓麗霞．耐亞胺培南銅綠假單胞菌的β－內(nèi)酰胺酶類耐藥基因研究［J］．大連醫(yī)科大學(xué)報(bào)，2009，31（5）：583．

［2］徐元宏，沈繼錄，楊佰俠，等．產(chǎn)金屬酶合并外膜蛋白缺失的銅綠假單胞菌的檢測(cè)［J］．中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2005，15（10）：1085．

［3］WangC，WangJ，MiZ．Pseudomonas aeruginosa producing VIM－2 metallo beta－lactamases and carrying two aminoglycoside－modifying enzymes in China［J］．Hosp Infect，2006，62（4）：522．

［4］Quale J，Bratu S，Gupta J，etal．Interplay of efflux system，ampC，and oprD expression in carbapenem resistance of Pseudomonas aeruginosa clinical isolates ［J］．Antimicrob Agents Chemother，2006，50（5）：1633．

［5］Diallo Mamadou Cherif，魏殿軍，曹 陽(yáng)，等．耐亞胺培南銅綠假單胞菌oprD2基因與金屬酶的檢測(cè)［J］．中華感染與化療雜志，2008，8（5）：369．

［6］熊 薇，王洪波，徐 敏，等．銅綠假單胞菌外膜蛋白OprD2缺乏和金屬β－內(nèi)酰胺酶與亞胺培南耐藥的關(guān)系［J］．中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2007，17（10）：1193．

［7］甘曉玲銅綠假單胞菌對(duì)碳青霉稀類抗生素的多重耐藥機(jī)制［J］．重慶醫(yī)學(xué)，2008，37（16）：1851．