高效液相色譜梯度參數(shù)優(yōu)化設置解析

張振巍，張娜娜，石 磊，張建民，白丹丹

進行高效液相色譜分析時，兩種洗脫方法：等度洗脫和梯度洗脫。等度洗脫是由不同溶劑構(gòu)成的固定比例的流動相，在整個洗脫過程中，流動相的極性、離子強度、pH值等因素皆保持不變。對于較復雜的中藥成分來說，只單純的用等度洗脫來分析中藥的成分，顯然有些力不從心，為此采用梯度洗脫，在此過程中可調(diào)節(jié)流動相的極性，改善樣品中每個組分的分離度從而達到徹底分離的目的。本文以反相鍵合相高效液相色譜為例，并以實際中藥材溶液作為樣品，介紹用二元混合溶劑流動相進行梯度洗脫的一般步驟，并優(yōu)化梯度洗脫參數(shù)的方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津LC2010CHT型高效液相色譜儀 （四元泵、在線脫氣、自動冷卻裝置、全自動進樣器、紫外檢測器）；梅特勒-托利多AB135-S雙量程電子天平 （瑞士）；AS10200ADT型超聲波清洗器。色譜甲醇（山東禹王實業(yè)有限公司化工分公司，批號20110103061）；實驗用水采用雙重蒸餾水；其它試劑均為分析純。

1.2 試藥 以赤芍藥材為樣品，按照2005版藥典第一部對赤芍藥材進行處理得到樣品溶液[2]。

2 優(yōu)化梯度洗脫方法的一般步驟

色譜柱Shim-Pack VP-ODS C18色譜柱（250mm×4.6mm，5 μm)；流動相甲醇-0.1%磷酸梯度洗脫；流速為 1.0 ml/min；檢測波長為227 nm；柱溫30℃，流動相∶溶劑 A-B∶甲醇-水（φA可變）。

2.1 建立梯度洗脫方法 用10%～100%甲醇－水溶液，以流速0.5 ml/min沖洗色譜柱，直至基線穩(wěn)定，按照2005版藥典第一部方法對赤芍藥材進行處理并作為樣品溶液，每次進樣10 μl。

在30 min內(nèi)，進行由10%～30%甲醇－水線性梯度洗脫（流速1.0 ml/min），流動相中強洗脫劑甲醇以每分鐘0.6%的梯度陡度進行洗脫。如圖1所示。

圖1 10%～30%甲醇-水線性梯度HPLC色譜圖

圖1中顯示死時間tM＝1.0 min，樣品中第一個峰與最后一個峰分的保留時間分別為ti＝1.105 min和tf＝23.366 min，此時末峰與首峰的保留時間差 Δtg為：Δtg＝tf-ti＝23.366 min-1.105 min＝22.261 min，梯度洗脫時間 tG為 30 min，依據(jù) Δtg/tG的比值，來判定是否需要進行梯度洗脫。判斷標準為[3]：Δtg/tG≤0.25，進行等度洗脫；Δtg/tG>0.25，進行梯度洗脫；在本分離中：Δtg/tG＝22.261/30＝0.742，由于 0.742>0.25，所以本次分離應進行梯度洗脫。

由圖1可以看出，首次進行梯度洗脫所確定的梯度洗脫時間tG并不合適，因在色譜圖中中部和結(jié)束存在時間上的浪費，經(jīng)DAD光譜掃描5號色譜峰純度不高，在219.4 nm和261.8 nm處各有1個強吸收峰，估計是沒有得到完全分離。此時的梯度陡度T=ΔφA/tG=0.2/30=0.0067，需要減小此時的梯度陡度，以改善分離情況，見圖2。

圖2 5號光譜圖

2.2 改變梯度洗脫條件 由圖1中造成洗脫時間浪費的原因，是由于梯度洗脫中強溶劑A選擇濃度A%變化范圍太寬引起的，為此可縮小A濃度的變化范圍，于是改用2次梯度洗脫的方法，在 0～10 min 內(nèi)采用 φA：10%～20%，此時的梯度陡度 T=ΔφA/tG=0.1/10=0.01，以縮短 1、2、3 號 3 個峰的保留時間；10～30 min 20%～30%，此時的梯度陡度 T=ΔφA/tG=0.1/20=0.005，以改善色譜峰5的分離情況。按照設置條件進行第二次梯度洗脫，獲得圖譜如圖3。

圖3 20%～30%甲醇-水線性梯度HPLC色譜圖

由圖3可以看出1號色譜峰之前，應該還有色譜峰的出現(xiàn)；原來的5號色譜峰已經(jīng)分離開6號，另外在4號峰前面又分離出8號峰，說明梯度條件的改善的確帶動了色譜峰的分離，由于5、6號2個色譜峰沒有徹底分開，所以要保持時間不變的情況下降低梯度陡度T，即0～10 min φA的比例變化為 15%～20%；10～30 min為 20%～35%，以改善色譜峰的分離。從而得到色譜圖4。

由圖4可以看出，色譜峰基本都已經(jīng)得到分離，并且此時得到的色譜峰數(shù)目最多，此時的梯度陡度 T0～10=ΔφA/tG=0.05/10=0.005，T10～30=ΔφA/tG=0.15/20=0.0075。筆者按照此流動相梯度把進樣時間提高到60 min未見有色譜峰的出現(xiàn)，確定赤芍藥材的色譜峰已經(jīng)分離完全。

圖4 20%～35%甲醇-水線性梯度HPLC色譜圖

3 討 論

為獲得理想的梯度洗脫分離效果和良好的重現(xiàn)性，必須在實驗中注意以下問題：

3.1 檢測波長的選擇 本文中采用二級管陣列檢測器對赤芍藥材的三維圖譜進行掃描，考察了257、260.5、263、265 nm，4個波段，綜合出峰最多、分離情況最好、基線最穩(wěn)定等因素選擇了260.5 nm作為檢測波長?？紤]到赤芍藥材自身的穩(wěn)定性，所以在用赤芍藥材進行梯度洗脫時還要考慮到赤芍成分的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，在24 h以后赤芍中的有些成分的色譜峰面積出現(xiàn)下降的趨勢，可能是藥材中某些成分的不穩(wěn)定導致。如果藥材本身的穩(wěn)定性差，更要優(yōu)化好梯度的條件，以使藥材成分在最短的時間內(nèi)得到較好的分離。

3.2 色譜柱的平衡 每一次梯度洗脫分析結(jié)束時，流動相的組成已和梯度洗脫開始時大不相同，為了進行下一次的梯度洗脫，必須用起始濃度的梯度流動相平衡一下色譜柱，直至基線穩(wěn)定。實驗證明用起始流動相使色譜柱平衡周期足夠長，才能獲得重現(xiàn)性較好的色譜圖。針對赤芍藥材，每次進樣結(jié)束以后都要進行一次較長時間的平衡色譜柱，才能在下次進樣時得到重現(xiàn)性較好的圖譜。如果色譜柱平衡的時間不夠，在色譜圖中早期洗脫峰的保留時間將會發(fā)生改變，而后洗脫譜峰的保留時間一般不受影響，當進行反相色譜梯度洗脫時，最好從5%或者超過5%的有機相開始，可縮短柱平衡的時間；若從純水開始進行梯度洗脫，則色譜柱就需要較長的平衡時間。

3.3 空白梯度 當開始進行梯度洗脫前，要進行一次空白溶液的梯度洗脫，即不注入樣品，僅按照梯度洗脫程序運行得到的基線。空白梯度實驗于樣品梯度洗脫程序完全相同的條件下進行，以確定所用的溶劑對色譜干擾程度，應盡量選擇干擾比較小的空白溶劑，得到置信度較高的色譜信息。筆者對空白梯度的流動相進行考察，選用去離子水、雙蒸水、超純水三者對比進樣，圖譜顯示使用超純水進行梯度空白可有效減少基線干擾。

3.4 梯度開始時間的滯后問題 當確定了洗脫程序以后，從t＝0開始梯度洗脫實驗操作，但由于實現(xiàn)梯度洗脫的儀器設備結(jié)構(gòu)或者電子控制系統(tǒng)的多種原因，使實際觀測到的梯度洗脫總是向后平移了一段時間，稱為梯度系統(tǒng)的滯后時間。并且由于水和有機溶劑的混合不是在無限小的空間內(nèi)完成的，而是在具有一定體積的梯度混合器內(nèi)實現(xiàn)，并與脈動阻尼器和連接的體積有關，這些體積越大，梯度洗脫的線性就越差，這同時也是衡量HPLC系統(tǒng)梯度洗脫線性優(yōu)劣的判定標準。

3.5 梯度方案的優(yōu)化 在本文中以改變梯度陡度，根據(jù)實際情況改變洗脫時間，從而達到優(yōu)化目的；也可以固定時間而通過改變梯度陡度達到洗脫的目的。如果在一個梯度洗脫中，聚集在色譜圖中間部分的組成過于密集，未能實現(xiàn)理想的分離，此時也可以改變梯度洗脫程序曲線的形狀，由一階梯度洗脫變成二階梯度洗脫，即在有2個梯度陡度的一階梯度洗脫中間部分加入適當時間間隔的等度洗脫部分，這樣就可以使色譜中間部分的組分色譜峰獲得理想的分離效果。

[1]Jandera P,Churacek J.Gradient elution in column liquid chormatograghy[M].Theory and Practice,Amsterdam,Elsevier,1985.59-129.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典.2010年版一部[M].北京：化學工業(yè)出版社，2005.109.

[3]于世林.高效液相色譜方法及應用[M].北京：化學工業(yè)出版社，2005.122-140.