應(yīng)激狀態(tài)對(duì)顳下頜關(guān)節(jié)內(nèi)P物質(zhì)影響的實(shí)驗(yàn)研究

王曉菲

顳頜關(guān)節(jié)病 （temporomandibular disorders，TMD）是人群中的一種常見病和多發(fā)病，治愈率低，病因復(fù)雜，臨床表現(xiàn)為一系列顳頜關(guān)節(jié)及附近組織疼痛、張口受限等癥狀，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量[1]。研究表明，SP廣泛分布于 TMJ（temporomandibuar joint）中，與TMJ病變的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[2]。與包括關(guān)節(jié)軟骨在內(nèi)的各種骨代謝有密切的關(guān)系[3，4]。目前，TMJ內(nèi)SP的相關(guān)應(yīng)研究多為定性研究，缺乏明確的定量研究來觀察應(yīng)激后TMJ內(nèi)SP的變化。因此，本研究在建立應(yīng)激動(dòng)物模型，通過定量觀察應(yīng)激前后TMJ內(nèi)SP相關(guān)神經(jīng)肽的變化，探討應(yīng)激因素與TMD的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 材料 SD大鼠，一級(jí)，60只，體重（150±10）g，雄性，由山東大學(xué)動(dòng)物中心提供。

1.2 儀器與設(shè)備 隨機(jī)應(yīng)激儀，自制，裝置分為兩部分即刺激儀和刺激籠。刺激儀在結(jié)構(gòu)上由隨機(jī)發(fā)生器和輸出電路組成。隨機(jī)發(fā)生器由2個(gè)震蕩器形成隨機(jī)組合的脈沖，經(jīng)延時(shí)后控制連續(xù)波發(fā)生器，后者產(chǎn)生4 Hz的連續(xù)頻率，它的持續(xù)時(shí)間即刺激時(shí)間可在2、5、10 s內(nèi)選擇，隨機(jī)形成的連續(xù)波經(jīng)輸出電路輸出，輸出脈沖的空載幅度為150 V。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和方法 將60只大鼠分為空白對(duì)照組、電擊組（foot-shocked，F(xiàn)S）、應(yīng)激組（emotional stress，ES）和藥物對(duì)照組（anti-anxiety-drug，AAD）15只/組。以上各組又隨機(jī)分為10、20、30 d三個(gè)亞組，5 只/組。

1.4 建模 模型建立時(shí)參考Rosales等[5，6]的模型。電擊組：每天固定時(shí)間給予電擊，30 min/d，電壓80 V，應(yīng)激頻率4 Hz，以維持受刺激動(dòng)物驚恐、緊張和憤怒的應(yīng)激狀態(tài)。應(yīng)激組：電擊組受電擊后排便，豎毛，尖叫等反應(yīng)影響該組大鼠。藥物對(duì)照組：試驗(yàn)前30 min給抗焦慮抑郁注射液注射量為1 mg/kg?？瞻讓?duì)照組：不給予以上應(yīng)激影響。各組大鼠的體重、性別通過均衡檢驗(yàn)，證實(shí)無顯著性差異。各組大鼠均為普通固體飼料，自由飲水，同等飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)開始前1周，將大鼠放入交流箱中適應(yīng)一段時(shí)間，不給予應(yīng)激。應(yīng)激時(shí)間設(shè)置為10 d組、20 d組和30 d組。其中電擊組大鼠僅作為應(yīng)激源，不參與實(shí)驗(yàn)測試。藥物對(duì)照組與應(yīng)激組大鼠一樣，同期、同樣的條件下開始實(shí)驗(yàn)，但藥物對(duì)照組大鼠在實(shí)驗(yàn)前30 min皮下注射抗焦慮抑郁藥。每天上午的固定時(shí)間給予應(yīng)激，以嚴(yán)格對(duì)照，保證研究結(jié)論的可靠性。

1.5 RT-PCR 取大鼠髁突，將髁突液氮處理并研磨。常規(guī)方法提取收集TMJ髁突軟骨組織的總核糖核酸（ribonucleic acid，RNA），采用反轉(zhuǎn)錄脫氧核糖核（Complementary deoxyrlibonucleic acid，cDNA）合成試劑盒合成cDNA，設(shè)計(jì)引物序列進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，β-actin用做內(nèi)定參考。

引物設(shè)計(jì)如下：SP （252bp） 上游：5’-GAG CCCTT TGA GCAT CTTCT-3’； 下 游 ：5’-ACG CCTTCTTTCGTAGTTCTG-3’。β-actin （422bp）上游：5’-GAGACCTTCAACACCCCAGCC-3’；下游：5’-TCGGGGCATCGGAACCGCTCA-3’。

PCR 擴(kuò)增：PCR 反應(yīng)總體積 25 μl， 包括：PCR Mix 10 μl， 上、 下游引物共 1 μl，cDNA 模板 2 μl，H2O 12 μl。 PCR 條件為 95℃預(yù)變性 5 min，94℃變性 1 min，58℃和 56℃退火 1 min，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)后，最后一個(gè)循環(huán)72℃ 10 min。

取 SP 及 β-actin，擴(kuò)增產(chǎn)物各 5 μl，混合后 2%瓊脂糖凝膠電泳1 h。RT-PCR電泳結(jié)果經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)的分析軟件進(jìn)行量化處理，用β-actin作內(nèi)參照，對(duì)SP基因表達(dá)的相對(duì)量進(jìn)行分析。用SPSS15.0軟件單因素方差分析對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié) 果

2.1 大體觀察 實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)S組大鼠有跳躍，翹尾，豎毛等行為表現(xiàn)，ES組大鼠有豎毛、恐慌等應(yīng)激行為表現(xiàn)。藥物對(duì)照組沒有豎毛、恐慌等應(yīng)激表現(xiàn)。各組取材時(shí)，同性別大鼠平均體重相似。各組大鼠無意外死亡。

2.2 SPRT-PCR結(jié)果 以β-actin擴(kuò)增產(chǎn)物作為內(nèi)參照進(jìn)行半定量分析：ES組SPmRNA的表達(dá)量最高，AAD組和對(duì)照組SPmRNA的表達(dá)量較低。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，ES組、AAD組和對(duì)照組均有顯著差異（P<0.05），AAD 組與對(duì)照組無顯著性差異（P>0.05）。

10 d時(shí)，ES組SP表達(dá)最高。AAD組神經(jīng)肽分子的表達(dá)略有升高，各組比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。20 d時(shí)，ES組相比10 d時(shí)顯著降低 （P<0.05），高于對(duì)照組與AAD組；AAD組相比10 d水平顯著降低 （P<0.05），與對(duì)照組無顯著差異 （P>0.05）。30 d時(shí)ES組和AAD組SP的表達(dá)水平顯著低于10 d與20 d（P<0.05），與對(duì)照水平無顯著差異（P>0.05）。

圖1 SPRT-PCR檢測結(jié)果圖

3 討 論

TMD指發(fā)生在TMJ 區(qū)及相應(yīng)的軟組織的一類以肌肉的疼痛、異常關(guān)節(jié)音及下頜運(yùn)動(dòng)異常和伴有功能障礙為主要特征的一組疾病的總稱，其在人群中的發(fā)病為20%～40%，是口腔醫(yī)學(xué)臨床最常見的疾病之一[7]。該病的病因比較復(fù)雜，對(duì)其病因和發(fā)病機(jī)理的研究表明，TMD是多種因素作用的結(jié)果，尤其與患者的情緒抑郁、環(huán)境壓力有著密切的關(guān)系，應(yīng)激因素對(duì)該病的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后有著重要的影響[8，9]。

20世紀(jì)50年代Schwartz等[10]報(bào)道了TMD與心理因素有關(guān)，此后關(guān)于應(yīng)激對(duì)口頜系統(tǒng)健康的影響乃至其在口頜肌功能紊亂、TMJ疼痛的發(fā)生、發(fā)展和治療效果方面的研究時(shí)有報(bào)道[10-13]，但迄今仍沒有確鑿的證據(jù)證明兩者之間存在直接因果關(guān)系。本研究參考了Rosales等[5，6]的應(yīng)激模型，并在此基礎(chǔ)上證實(shí)了應(yīng)激對(duì)TMJ具有一定的影響。

SP具有促進(jìn)肥大細(xì)胞脫落，釋放組胺及5羥色胺等各種傷害性刺激因子，誘導(dǎo)滑膜細(xì)胞中DNA和蛋白質(zhì)的合成與分裂作用[14]。能與已知的滑膜細(xì)胞的另兩種刺激因子白細(xì)胞介素-1和腫瘤壞死因子有相互作用，共同發(fā)揮對(duì)滑膜細(xì)胞的作用。如壓力、精神緊張和炎癥介質(zhì)等，都能激活傷害感受器引起SP合成和釋放增加。本文結(jié)果提示在應(yīng)激因素引起的TMJ病變過程中的初期，SP合成和釋放增加，會(huì)對(duì)表面滑膜細(xì)胞產(chǎn)生作用，致使表層膠原纖維的破壞；隨著應(yīng)激時(shí)間的延長，動(dòng)物對(duì)應(yīng)激的慢慢適應(yīng)，SP合成和釋放減少，癥狀可能會(huì)有所減輕。

本文結(jié)果說明應(yīng)激對(duì)TMJ的影響可能是體內(nèi)多種相關(guān)神經(jīng)肽分子變化的作用?？蔀轭A(yù)防和治療與應(yīng)激相關(guān)的TMD提供理論依據(jù)。可為進(jìn)一步闡明心理因素與TMD的關(guān)系提供了理論依據(jù)，對(duì)臨床雙軸診斷和治療具有一定的理論指導(dǎo)義意。

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