楊旭升，馬志軍，郭春景

（1.黑龍江省科學(xué)院，黑龍江哈爾濱150001；2.黑龍江省科學(xué)院大慶分院，黑龍江大慶163316）

生物固氮每年為全球提供絕大多數(shù)的的氮素營(yíng)養(yǎng)，其中大約80%是由共生固氮生物所固定的，而根瘤菌與豆科植物共生固氮是固氮作用最強(qiáng)的體系[1～3]。豆科牧草以其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，適口性好，有著很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，在全世界范圍內(nèi)得到廣泛種植，許多國(guó)家都以苜蓿作為重要的農(nóng)牧業(yè)支柱作物。研究結(jié)果表明，在土壤氮素營(yíng)養(yǎng)成分相同的條件下，一種根瘤菌并不能使不同苜蓿品種獲得同樣的接種效果，對(duì)一個(gè)苜蓿品種可以產(chǎn)生良好固氮效果的菌株，對(duì)另一苜蓿品種可能固氮效果一般，這種固氮效果的差異現(xiàn)象，說(shuō)明根瘤菌與寄主植物之間需要很好的匹配，才能使苜蓿獲得最佳的接種固氮效果[4～7]。陳文新院士等經(jīng)過(guò)二十多年的研究，提出了有關(guān)根瘤菌與豆科植物共生關(guān)系的結(jié)論：同一種植物在不同生態(tài)環(huán)境中可與不同根瘤菌結(jié)瘤固氮，同一生態(tài)環(huán)境條件下不同植物可與同一根瘤菌共生固氮。因此，進(jìn)行根瘤菌接種劑選種時(shí)，必須針對(duì)種植的生態(tài)環(huán)境及寄主植物兩方面的因素，來(lái)選擇與苜蓿最佳匹配的根瘤菌，而不是只考慮與寄主的匹配，并認(rèn)為過(guò)去研究生物固氮只考慮與寄主植物的關(guān)系，很可能是接種效果不穩(wěn)定的一個(gè)重要原因[8～12]。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試的紫花苜蓿品種

巨人201苜蓿,金皇后苜蓿,馴鹿苜蓿,肇東苜蓿和敖漢苜蓿,共5個(gè)北方寒地草場(chǎng)中主栽的苜蓿品種,由黑龍江省科學(xué)院生物肥料研究中心保藏、提供。

1.1.2 供試的苜蓿根瘤菌菌種

SM29，SM30，SM32，SM33，SM35，SM36，SM37，SM38，SM39，SM40，SM41，共 11株，由黑龍江省科學(xué)院生物肥料研究中心保藏、提供。

1.1.3 供試蛭石

由河北靈壽源通礦產(chǎn)品加工廠(chǎng)生產(chǎn)。

1.1.4 試驗(yàn)用低氮營(yíng)養(yǎng)液配方

0.03 g Ca (NO3)2，0.15g Na2HPO4，0.1g CaCl2·2H2O，0.12g MgSO4·2H2O，0.10g KH2PO4，0.05g 檸檬酸鐵和 1 mL 微量元素(配方：2.86g H2BO3，1.81g MnSO4，0.80g CuSO4·5H2O，0.02g H2MoO4,1L 蒸餾水)。拌勻蛭石后，把蛭石裝入耐高溫的塑料杯中，連同供水系統(tǒng)在121℃條件下滅菌3h，獲無(wú)菌蛭石。

1.1.5 根瘤菌YMA培養(yǎng)基

10g 甘 露 醇 ，0.25g K2HPO4，0.25g KH2PO4，0.2g MgSO4，0.1gNaCl，3gCaCO3，lL 蒸餾水，固體另加 1.5g瓊脂粉，pH值6.8～7.2。

1.2 方法

1.2.1 菌株的培養(yǎng)及種子的催芽

將供試菌株分別接種到克氏瓶中YMA培養(yǎng)基平面上，28℃培養(yǎng)36h，用大約100mL無(wú)菌水洗下菌體，裝入無(wú)菌三角瓶中，旋渦振蕩打散菌體后,取一部分測(cè)其OD值 (600 nm)，使每毫升菌懸液中根瘤菌數(shù)量達(dá)20億個(gè)。苜蓿種子經(jīng)95%乙醇處理15min，用無(wú)菌水沖洗5～8次，再用0.1%的HgCl進(jìn)行表面消毒4min之后,用無(wú)菌水沖洗7～8次,分別用沙皿法在28℃下催芽。

1.2.2 蛭石栽培及接種

取l培養(yǎng)皿加入1種備用的菌懸液適量 (以淹沒(méi)種子為宜)再加入發(fā)芽一致、芽長(zhǎng)約1cm的1種苜蓿種子,浸泡15min,用無(wú)菌鑷子夾取植入裝有無(wú)菌蛭石的塑料杯中，每杯種植4顆，再沿各植株根部加入該菌液2 mL，使每個(gè)處理中含菌量達(dá)到40億個(gè),中苜l號(hào)、RS分別用10種不同根瘤菌進(jìn)行接種處理，Vector、WL323分別用8種不同根瘤菌進(jìn)行接種處理，各個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，各品種(或品系)以不接菌作為空白對(duì)照，同樣設(shè)3個(gè)重復(fù)。以上操作均在無(wú)菌操作臺(tái)上進(jìn)行，最后轉(zhuǎn)入光照強(qiáng)度為9000Lx，白天溫度為(23±5)℃，晚上溫度為(18±2)℃，日照時(shí)數(shù)16 h的溫室中培養(yǎng)。

1.3 接種效果的測(cè)定

待植物生長(zhǎng)到45d后進(jìn)行收獲。收獲時(shí)把根用水洗干凈，分別測(cè)定每株植物的有效根瘤數(shù)(以呈現(xiàn)粉紅色為標(biāo)準(zhǔn))、總根瘤數(shù)、植物地上部分干重(以第1片子葉葉痕處作為劃分標(biāo)準(zhǔn)，苜蓿樣品在80℃烘干到恒重后稱(chēng)其干重)。計(jì)算出單株的平均有效根瘤數(shù)、平均總根瘤數(shù)和地上部分平均于重，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和處理。

2 結(jié)果與分析

我們進(jìn)行了所選用的苜蓿根瘤菌菌株（11株）與我們所選用的在黑龍江省大面積栽培的苜蓿品種（巨人201，金皇后，馴鹿，肇東苜蓿，敖漢）進(jìn)行最佳共生匹配的雙瓶試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1-5。

從表1的試驗(yàn)結(jié)果中可以看出，接種SM32、SM33、SM35、SM39和SM41的苜蓿植株在株高、葉片顏色、結(jié)瘤數(shù)、瘤干重和植株地上部分干重等幾個(gè)考察的生物學(xué)指標(biāo)中明顯地優(yōu)于接種其它幾個(gè)菌株的苜蓿植株。

表1 苜蓿根瘤菌與巨人201苜蓿最佳共生配對(duì)試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Optimum symbiosis matching results of Sinorhizobium meliloti with the Juren 201

表2 苜蓿根瘤菌與金皇后苜蓿最佳共生配對(duì)試驗(yàn)Table 2 Optimum symbiosis matching results of Sinorhizobium meliloti with Golden Empress alfalfa

從表2的試驗(yàn)結(jié)果中可以看出，接種苜蓿根瘤菌SM32、SM33、SM35、SM40 和 SM41 的苜蓿植株在株高、葉片顏色、結(jié)瘤數(shù)、瘤干重和植株地上部分干重等幾個(gè)考察的生物學(xué)指標(biāo)中，明顯地優(yōu)于接種其它幾個(gè)菌株的苜蓿植株。

從表3的試驗(yàn)結(jié)果中可以看出，接種苜蓿根瘤菌SM32、SM35、SM38 SM341、和 SM39 的苜蓿植株在株高、葉片顏色、結(jié)瘤數(shù)、瘤干重和植株地上部分干重等幾個(gè)考察的生物學(xué)指標(biāo)中明顯地優(yōu)于接種其它幾個(gè)菌株的苜蓿植株。

表3 苜蓿根瘤菌與傲寒最佳共生配對(duì)試驗(yàn)Table 3 Optimum symbiosis matching results of Sinorhizobium meliloti with Aohan

表4 苜蓿根瘤菌與馴鹿苜蓿最佳共生配對(duì)試驗(yàn)Table 4 Optimum symbiosis matching results of Sinorhizobium meliloti with reindeer alfalfa

從表4的試驗(yàn)結(jié)果中可以看出，接種苜蓿根瘤菌SM32、SM33、SM35、SM39 和 SM41 的苜蓿植株在株高、葉片顏色、結(jié)瘤數(shù)、瘤干重和植株地上部分干重等幾個(gè)考察的生物學(xué)指標(biāo)中，明顯地優(yōu)于接種其它幾個(gè)菌株的苜蓿植株。

從表5的試驗(yàn)結(jié)果中可以看出，接種苜蓿根瘤菌SM32、SM35、SM39、SM40 和 SM41 的苜蓿植株在株高、葉片顏色、結(jié)瘤數(shù)、瘤干重和植株地上部分干重等幾個(gè)考察的生物學(xué)指標(biāo)中明顯地優(yōu)于接種其它幾個(gè)菌株的苜蓿植株。

表5 苜蓿根瘤菌與肇東苜蓿最佳共生配對(duì)試驗(yàn)Table 5 Optimum symbiosis matching results of Sinorhizobium meliloti with Zhaodong alfalfa

比較5組試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果，證明在供試的11個(gè)苜蓿根瘤菌菌株中，SM32、SM35 、SM39、SM41 這四株苜蓿根瘤菌與我省寒地草場(chǎng)中廣泛栽培的具有代表性的5個(gè)苜蓿品種進(jìn)行的共生匹配試驗(yàn)中，均表現(xiàn)出了良好的固氮結(jié)瘤效果，接種它們的苜蓿在株高、葉色、結(jié)瘤數(shù)和植株地上部分干重等指標(biāo)上，均明顯地優(yōu)于接種其它的根瘤菌菌株的植株，根據(jù)上述的研究結(jié)果，我們篩選出了 SM32、SM35 、SM39、SM41 這四個(gè)與我省寒地草場(chǎng)中主栽的苜蓿品種最佳共生匹配的苜蓿根瘤菌菌株。

3 結(jié) 論

苜蓿作為一種適種于荒漠、干旱、貧瘠地區(qū)的先鋒植物，能很好地適應(yīng)我國(guó)北方寒地草場(chǎng)地區(qū)的自然環(huán)境。當(dāng)前正在進(jìn)行的退耕還林還草工程，需要大面積種植豆科灌木和牧草，接種根瘤菌是解決大面積人工林場(chǎng)、草場(chǎng)“氮素營(yíng)養(yǎng)缺乏”問(wèn)題的有效途徑[13～15]。因此，研究苜蓿與根瘤菌之間的最佳共生匹配關(guān)系，使苜蓿獲得最佳固氮效果，大力推廣根瘤菌接種技術(shù)，不僅可以改善北方寒地草場(chǎng)地區(qū)的土壤微生態(tài)環(huán)境，而且還可以推動(dòng)該地區(qū)的畜牧業(yè)的發(fā)展。所有根瘤菌并不能使同一苜蓿品種獲得同樣的接種效果，只有根瘤菌與寄主植物具有很好的匹配性，才能獲得最佳的共生結(jié)瘤固氮效果。本文進(jìn)行了北方寒地草場(chǎng)中主栽的5個(gè)紫花苜蓿品種分別接種11株不同的根瘤菌在溫室條件下的最佳共生匹配試驗(yàn)，從中篩選出了與不同紫花苜蓿品種具有最佳結(jié)瘤固氮效果的根瘤菌，為最終用于苜蓿栽培生產(chǎn)，提高苜蓿產(chǎn)量和品質(zhì)，以及豆科牧草接種根瘤菌篩選高效菌株，建立起一套行之有效的根瘤菌選種技術(shù)方法[16，17]。

[1]康麗華,李素翠.相思苗木接種根瘤菌的研究[J］.林業(yè)科學(xué)研究，1998，1l(4)：343～349.

[2]中國(guó)草原學(xué)會(huì).中國(guó)草地科學(xué)進(jìn)展(第四屆第二次年會(huì)暨學(xué)術(shù)討論會(huì)文集)[G］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，1998,132～135.

[3]馬其東，劉自學(xué)，洪紱曾,等.不同根系發(fā)育能力的苜蓿品種接種根瘤菌的效果[J］.草業(yè)學(xué)報(bào)，1999,8(4)：36～45.

[4]寧國(guó)贊，劉惠琴，子曉彤.生物固氮技術(shù)在退耕還林還草中的應(yīng)用[J］.中國(guó)草地，2001，23(4)：69～72.

[5]馬興祥，劉明春，尹東.祁連山草原氣候和草地資源開(kāi)發(fā)利用[J］.草原與草坪,2000，3：37～39.

[6]周敏.中國(guó)苜蓿栽培史初探[J］.草原與草坪，2004，1：44～46.

[7]胡自治.人工草地在我國(guó)21世紀(jì)草業(yè)發(fā)展和環(huán)境治理中的重要意義[J］.草原與草坪,2000，1：12～16.

[8]張志芳.利用根瘤菌提高紅豆草根瘤菌能力的研究[J］.草業(yè)科學(xué)，1996.13(6)：45～47.

[9]魯鴻佩，孫愛(ài)華，張榕，等.寧夏地區(qū)紅豆草紫花苜蓿與無(wú)芒雀麥混播接種根瘤菌效果的試驗(yàn)報(bào)告[J］.中國(guó)草食動(dòng)物，1999，(專(zhuān)輯)24～25.

[10]王志明，岳民勤.紫花苜蓿根瘤菌接種劑量的試驗(yàn)初報(bào)[J］.中國(guó)草食動(dòng)物，2000，(專(zhuān)輯)30～31.

[11]喻文虎,張志芳.紅豆革紫花苜蓿根瘤菌接種研究[J］.草業(yè)科學(xué)，1995，12(3)：22～26.

[12]沈世華，荊玉祥.中國(guó)生物固氮研究現(xiàn)狀和展望[J］.科學(xué)通報(bào)，2003，48(6)：532～540.

[13]林稚蘭，黃秀梨.現(xiàn)代微生物學(xué)與實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M］.北京：科學(xué)出版社，2000.9～13.

[14]曾昭海.紫花苜蓿高效根瘤菌篩選及田問(wèn)鑒定方法研究[D］.中圍農(nóng)業(yè)大學(xué)博十學(xué)位論文，2003.

[15]寧同贊，劉慧琴.中國(guó)豆科牧草根瘤菌資源的采集寶藏及利用[J］.草地學(xué)撤,1999，7(2)：165～172.

[16]陳丹明，曾昭海，隋新華,等.紫花苜蓿高效共生根瘤菌的篩選[J］.草業(yè)科學(xué)，2002，19(6)∶27～3l.

[17]陳文新，李阜棣.我國(guó)土壤微生物學(xué)和生物同氮研究的回顧與展望[D］.院士論壇,世界科技研究與發(fā)展.2002，4：6～12.