王東凱，楊志興

（1.黑龍江省對(duì)俄工業(yè)技術(shù)合作中心,黑龍江哈爾濱150090;2.黑龍江省科學(xué)院高技術(shù)研究院，黑龍江哈爾濱150090）

蘇云金芽孢桿菌（Bt）是一種細(xì)菌，自1901年首次報(bào)道蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）以來(lái)，已整整一百年了。法國(guó)于1938年生產(chǎn)出Bt生物制劑防治地中海粉螟。1951年Stainhaus用Bt培養(yǎng)物防治美洲苜蓿粉蝶。1953年Hannay首次發(fā)現(xiàn)了Bt的殺蟲(chóng)活性與伴孢晶體有關(guān)。1955年Hannay和Fitz—James證實(shí)，伴孢晶體是一種由18種氨基酸組成的蛋白質(zhì)，它是伴隨著芽孢的形成而產(chǎn)生的代謝物或分泌物。蘇云金芽孢桿菌的殺蟲(chóng)機(jī)理是晶體蛋白經(jīng)昆蟲(chóng)的口器覓食感染后，在堿性胃液作用下，體內(nèi)專一性酶參與中，分解成毒蛋白—毒肽，穿透腸壁進(jìn)入血液。同時(shí)，活芽孢在體內(nèi)大量繁殖，使害蟲(chóng)患敗血癥死亡。因此，Bt制劑對(duì)腸胃呈酸性的人、畜、禽、水生動(dòng)物及害蟲(chóng)天敵都是安全無(wú)毒的，是一種無(wú)公害、無(wú)污染、無(wú)殘留、無(wú)藥害的微生物殺蟲(chóng)劑[1，2]。

我國(guó)自20世紀(jì)50年代末開(kāi)始蘇云金桿菌殺蟲(chóng)劑的研究工作。在Bt資源方面，我國(guó)已分離到8000多株Bt菌株，完成鑒定和測(cè)試的大約有2000余株，在全世界已知的70個(gè)H血清型的83個(gè)亞種中，我國(guó)發(fā)現(xiàn)了41個(gè)H血清型和無(wú)鞭毛型的菌株，鑒定了12個(gè)新亞種。

蘇云金芽孢桿菌是目前世界上用途最廣、產(chǎn)量最大的微生物殺蟲(chóng)劑，已有60多個(gè)國(guó)家登記了120多個(gè)品種，廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、林業(yè)和貯藏害蟲(chóng)的防治。Bt殺蟲(chóng)劑將高速發(fā)展，其銷售額將從占農(nóng)藥總額的1%提高到10%。安全、有效地控制農(nóng)作物病蟲(chóng)害永遠(yuǎn)是發(fā)展種植業(yè)生產(chǎn)需要解決的技術(shù)課題。生物農(nóng)藥是21世紀(jì)控制農(nóng)業(yè)生物技術(shù)革命的生長(zhǎng)點(diǎn)和農(nóng)業(yè)生態(tài)保護(hù)的突破口。在這個(gè)新興的科技產(chǎn)業(yè)領(lǐng)域里，發(fā)達(dá)國(guó)家始終走在發(fā)展中國(guó)家的前面，并且通過(guò)技術(shù)產(chǎn)品影響和左右著全球的農(nóng)藥市場(chǎng)發(fā)展。我國(guó)作為一個(gè)人口眾多，人均資源偏少、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)水平相對(duì)較低、市場(chǎng)供求矛盾的發(fā)展中國(guó)家，促進(jìn)生物農(nóng)藥的產(chǎn)業(yè)發(fā)展，是21世紀(jì)實(shí)現(xiàn)自身農(nóng)產(chǎn)品安全生產(chǎn)和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要技術(shù)保障[3,4]。

本文是報(bào)告利用引進(jìn)俄羅斯蘇云金芽孢桿菌猝倒亞種（Bacillus thuringiensis subsp.sotto）發(fā)酵生產(chǎn)微生物Bt殺蟲(chóng)劑的研究技術(shù)方法和應(yīng)用結(jié)果。以便推廣應(yīng)用生產(chǎn)綠色食品，有利于環(huán)境友好和人類安全。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材 料

培養(yǎng)基及化學(xué)試劑：LB液體培養(yǎng)基,營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，豆餅粉，玉米粉，大豆蛋白胨，糊精，蛋白胨，葡萄糖，硫酸銨，磷酸氫二鉀，碳酸鈣，硫酸鎂,氯化鈉，硫酸亞鐵，磷酸二氫鉀，消泡劑等。

1.2 儀器與設(shè)備

OLYMPUS萬(wàn)用顯微鏡，分光光度計(jì)，20L自控發(fā)酵罐，德國(guó)貝朗公司生產(chǎn)；恒溫?fù)u瓶機(jī)，哈爾濱東勝儀器公司生產(chǎn)；500L發(fā)酵罐，上海發(fā)酵設(shè)備工廠生產(chǎn)。

2 方 法

2.1 將活化好的菌種以2%接種量接種于250ml三角瓶的50mlLB液培養(yǎng)基中。分別置于20℃、25℃、30℃和37℃四種溫度下培養(yǎng)。每隔一段時(shí)間取樣染色鏡檢。觀察細(xì)菌生長(zhǎng)發(fā)育情況。

2.2 將2.1中的發(fā)酵液分別測(cè)定不同培養(yǎng)時(shí)間的吸光值0D600，依照此值可以判斷菌的生長(zhǎng)曲線。

2.3 液體發(fā)酵培養(yǎng)基的制備

將玉米粉和豆粉經(jīng)研磨后，100目銅篩過(guò)濾，收集粉末。制備罐發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉6%、豆粉2%、糊精0.5%、碳酸鈣0.1%、硫酸鎂0.03%、磷酸二氫鉀0.2%、蛋白胨0.2%、硫酸銨0.03%，調(diào)節(jié)pH至7.2。滅菌備用。

2.4 發(fā)酵周期的測(cè)定

將各種培養(yǎng)基按其配方制備，滅菌，將葡萄糖溶解在蒸餾水中，滅菌。以2%接種量接種，轉(zhuǎn)數(shù)170rpm、30℃培養(yǎng)。利用結(jié)晶紫染色法進(jìn)行顯微觀察，通過(guò)鏡檢，當(dāng)視野中90%以上為芽孢，并且有大量的晶體游離時(shí)，停止發(fā)酵并記錄發(fā)酵時(shí)間。

2.5 活芽孢數(shù)的測(cè)定

將發(fā)酵液以10-1進(jìn)行梯度稀釋，取10-5、10-6、10-7稀釋度的菌液在80℃加熱15 min后吸取100ul涂布營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，每稀釋度涂3塊平板，放置在30℃培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)。翌日觀察菌落數(shù)，選擇菌落數(shù)在100個(gè)左右的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。取平均值，確定發(fā)酵液中的活芽孢數(shù)，并重復(fù)2次。

2.6 20L發(fā)酵罐發(fā)酵方法

2.6.1 接種

經(jīng)活化的菌種，轉(zhuǎn)接搖瓶培養(yǎng)。在搖瓶培養(yǎng)的菌種生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，鏡檢無(wú)雜菌、著色均勻，粗壯。以2%濃度接種。

2.6.2 罐發(fā)酵條件

溫度：30℃±1℃；起始轉(zhuǎn)數(shù)：200rpm；通氣量（v/v）：1～4 h,1：0.4；5～12h，1：0.6；12～20h,1：0.8。發(fā)酵過(guò)程中利用通氣量和攪拌速度的調(diào)節(jié)來(lái)控制溶氧值，使最低溶氧值保持在10%以上，攪拌速度控制在200rpm和500rpm之間。

2.6.3 采收條件

發(fā)酵過(guò)程中pH值有明顯的變化，伴隨著芽孢的形成和晶體的釋放，pH值有明顯的由低到高的上升階段。通過(guò)鏡檢，當(dāng)視野中可以觀察到芽孢和形狀完整的晶體，而且90%芽孢晶體游離時(shí)，可以下罐。

2.7 500L發(fā)酵罐生產(chǎn)Bt的方法

2.7.1 培養(yǎng)基的制備

培養(yǎng)基組成如500L罐，發(fā)酵液體積為350L，罐發(fā)酵培養(yǎng)基組成及發(fā)酵條件等同20L罐。

2.8 實(shí)驗(yàn)室Bt生物活性測(cè)定方法

菜粉蝶幼蟲(chóng)為實(shí)驗(yàn)材料，采用葉片浸漬法，在實(shí)驗(yàn)室中測(cè)定Bt不同稀釋濃度對(duì)菜粉蝶幼蟲(chóng)的致死濃度，以確定Bt的生物活性。

2.8.1 供試?yán)ハx(chóng)及蔬菜

供試菜粉蝶（piere rapae）捕自哈爾濱市道里區(qū)榆樹(shù)鄉(xiāng)甘藍(lán)菜田。在室外網(wǎng)籠內(nèi)養(yǎng)殖，為其提供水和蜂蜜營(yíng)養(yǎng)水。網(wǎng)籠內(nèi)放入盆栽甘藍(lán)和白菜，供菜粉蝶產(chǎn)卵于葉背。藥效測(cè)定用3～4齡健康幼蟲(chóng)。測(cè)試用蔬菜為本室提供的甘藍(lán)、葉片隨采隨用，均無(wú)農(nóng)藥污染。

2.8.2 供試菌劑和室內(nèi)藥效生物測(cè)定

供試Bt菌劑為發(fā)酵罐培養(yǎng)的Bt發(fā)酵液，菌懸液濃度為3.4×109cfu/ml。采用倍比稀釋法，配制成5個(gè)系列濃度。在直徑12cm平皿內(nèi)，放入幼蟲(chóng)6頭，將大小一致的葉片在不同濃度的菌液中浸漬片刻，取出晾干，分別放入平皿中，每一濃度處理5個(gè)平皿，以清水浸漬的葉片為對(duì)照，然后用食品保鮮膜封閉皿口，統(tǒng)一置于27℃±1℃的光照溫箱中，48h后檢查，計(jì)算幼蟲(chóng)死亡率以及LC50值。

3 結(jié)果與討論

3.1 確定30℃為蘇云金芽孢桿菌的最適生長(zhǎng)溫度

為了確定引進(jìn)蘇云金芽孢桿菌的最適生長(zhǎng)溫度。研究了在不同培養(yǎng)溫度下蘇云金芽孢桿菌菌體形態(tài)、芽孢和晶體產(chǎn)生情況和菌種的特性，按照方法1和2進(jìn)行菌體形態(tài)、芽孢和晶體產(chǎn)生情況的研究及發(fā)酵液0D600吸光值測(cè)定，其結(jié)果列入表1和表2，從該數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn)，在20℃，培養(yǎng)48h和引進(jìn)的蘇云金芽孢桿菌不產(chǎn)生芽孢和晶體[7]，而37℃菌株形成芽孢但不產(chǎn)生晶體。通過(guò)發(fā)酵周期與菌液濃度的0D600吸光值測(cè)定發(fā)現(xiàn)，如表2所示，在30℃培養(yǎng)時(shí)，芽孢和晶體形態(tài)生長(zhǎng)發(fā)育正常，而且發(fā)酵時(shí)間短，因此確定30℃為本株蘇云金芽孢桿菌的最適生長(zhǎng)溫度[8]。

表1 不同培養(yǎng)溫度下蘇云金芽孢桿菌菌體形態(tài)、芽孢和晶體產(chǎn)生情況Table 1 Situation of Bacillus thuringiensis bacteria form spores and crystals at diffrented cultured temperature

表2 菌株在不同培養(yǎng)溫度下的0D600值Table 2 0D600of fermented liquid at diffrented cultured temperature

3.2 確定菌株搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基

玉米粉6%、豆粉2%、糊精0.5%、蛋白胨0.2%、碳酸鈣0.1%、硫酸鎂0.03%、磷酸二氫鉀0.2%、硫酸銨0.03%。參照方法2.6.2和2.3.3，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)根據(jù)俄羅斯提供的技術(shù)材料，對(duì)影響蘇云金芽孢桿菌生長(zhǎng)的幾種培養(yǎng)基成分進(jìn)行分析，以提高蘇云金芽孢桿菌的效價(jià)。用稀釋平板計(jì)數(shù)法測(cè)定發(fā)酵液含菌數(shù)，對(duì)存在差異的成分進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果列入表3至表7中經(jīng)過(guò)鏡檢和活芽孢數(shù)的測(cè)定，結(jié)果如表3所示。

3.2.1 玉米粉培養(yǎng)基鹽類差異實(shí)驗(yàn)

玉米粉培養(yǎng)基中其他組分濃度為：碳酸鈣0.1%、硫酸鎂0.03%、磷酸二氫鉀0.2%、蛋白胨0.2%、糊精0.5%、豆粉2%。

表3 玉米粉培養(yǎng)基鹽類差異實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Experiment results of diffrented salts in cornmeal medium

3.2.2 葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基氮源差異試驗(yàn)結(jié)果

其他組分濃度為碳酸鈣0.1%、硫酸鎂0.03%、磷酸二氫鉀0.2%、蛋白胨0.2%，如表4所示。

表4 葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基氮源差異結(jié)果Table 4 Glucose-peptone medium N resource diffrented fermented results

同時(shí)，對(duì)不同濃度玉米粉培養(yǎng)基發(fā)酵周期進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表5所示在碳氮源的選擇上，雖然文獻(xiàn)的報(bào)道豆粉對(duì)菌株的生長(zhǎng)影響不大，但是玉米粉的濃度對(duì)發(fā)酵水平有著絕對(duì)的影響，測(cè)定結(jié)果玉米粉6%的濃度活菌數(shù)最高。

表5 玉米粉培養(yǎng)基發(fā)酵周期Table 5 Cornmeal medium fermented period

此外，不同濃度氮源葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基也影響發(fā)酵周期。

3.2.3 在葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，大豆脫脂蛋白胨在2%的濃度獲得了較高的活菌數(shù)，并且可以有效的縮短發(fā)酵周期如表6所示。葡萄糖單獨(dú)滅菌確實(shí)可以有效提高發(fā)酵水平，但是實(shí)際生產(chǎn)中這種生產(chǎn)方式并完全適合，而且從成本角度出發(fā)玉米粉培養(yǎng)基更加經(jīng)濟(jì)實(shí)惠，是現(xiàn)在普遍采用的生產(chǎn)用培養(yǎng)基。

表6 葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基發(fā)酵周期Table 6 Glucose-peptone medium fermented period

另外，通過(guò)鹽類差異實(shí)驗(yàn)可以看出硫酸銨培養(yǎng)基的總體發(fā)酵水平高于硫酸亞鐵和氯化鈉培養(yǎng)基，文獻(xiàn)報(bào)道NH4+可以刺激外毒素的產(chǎn)生，提高伴孢晶體的產(chǎn)量。而且高鹽濃度會(huì)破壞產(chǎn)孢和外毒素的相關(guān)性。

3.3 20L罐發(fā)酵幾批次的發(fā)酵結(jié)果

通過(guò)活芽孢計(jì)數(shù)罐發(fā)酵水平可以達(dá)到5.4×109cfu/ml，發(fā)酵周期20～24h。發(fā)酵液每毫升活芽孢數(shù)比搖瓶發(fā)酵提高1個(gè)數(shù)量級(jí)。所獲得的發(fā)酵液，經(jīng)過(guò)稀釋可應(yīng)用于各種實(shí)驗(yàn)[7,8]。

3.4 500L發(fā)酵實(shí)驗(yàn)與生產(chǎn)結(jié)果

參照2.7所述方法，進(jìn)行3批次的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)所取得的結(jié)果列入表7中，發(fā)酵液通過(guò)活芽孢計(jì)數(shù)，罐發(fā)酵水平達(dá)到4.4×109cfu/ml，發(fā)酵周期為20～24h。發(fā)酵液每毫升活芽孢數(shù)量比搖瓶發(fā)酵水平提高1個(gè)數(shù)量級(jí)。

表7 500立升罐3批次的發(fā)酵結(jié)果Table 7 Fermented result using 500 litre fermented tank

最終優(yōu)化的發(fā)酵條件為：溫度：30℃±1℃；起始轉(zhuǎn)數(shù)：300rpm；通氣量（v/v）：1～4h,1：0.4;5～12h,1：0.6；12～20h，1：0.8。發(fā)酵過(guò)程中利用通氣量和攪拌速度的調(diào)節(jié)來(lái)控制溶氧值，使最低溶氧值保持在10%以上，攪拌速度控制在200rpm和400rpm之間。

當(dāng)發(fā)酵達(dá)到90%芽孢晶體游離時(shí)，完成發(fā)酵下罐，收集發(fā)酵液在300L左右。平均活芽孢數(shù)量達(dá)到4.4×109cfu/ml.利用此發(fā)酵液可以加工成不同劑型應(yīng)用[6～8]。

3.5 發(fā)酵的Bt菌劑實(shí)驗(yàn)室生物活性測(cè)定結(jié)果良好

參照方法2.8.2,進(jìn)行發(fā)酵液的Bt菌劑實(shí)驗(yàn)室生物活性測(cè)定，其結(jié)果列入表8中，表中數(shù)據(jù)顯示：實(shí)驗(yàn)組中菜粉蝶幼蟲(chóng)的死亡率與菌懸液的濃度成正比，即濃度越大的組死亡率越高[3,5]。菜粉蝶幼蟲(chóng)感染初期，食欲減退，對(duì)外部刺激反應(yīng)不靈敏，死亡后蟲(chóng)體往往伸展呈現(xiàn)腐爛狀，不久蟲(chóng)體由綠色變?yōu)楹谏?。菜粉蝶幼蟲(chóng)死亡率列入表8，對(duì)照組無(wú)死亡，因此無(wú)校正死亡率。

表8 Bt菌劑實(shí)驗(yàn)室生物活性測(cè)定結(jié)果Table 8 Bt laboratory bio-activity assay result

根據(jù)菌懸液濃度的對(duì)數(shù)值和菜粉蝶幼蟲(chóng)死亡率的機(jī)率值作圖，見(jiàn)圖1。

圖1 Bt菌劑毒力回歸曲線Fig.1 Bt virulence regression curve

圖1 表明：從毒力回歸方程和圖中的毒力曲線

求出菌懸液的LC50值等于2.3×106cfu/ml。施藥5d后，Bt菌懸液50倍和100倍防效達(dá)到100%，200倍稀釋液的防效達(dá)到90%以上。因此，Bt菌懸液具有很好的應(yīng)用效果，完全可以使用。

蘇云金芽孢桿菌可以毒殺害蟲(chóng)，其關(guān)鍵在于它產(chǎn)生大量伴孢晶體，但是不同菌株產(chǎn)生的伴孢晶體量不同，引進(jìn)俄羅斯蘇云金芽孢桿菌猝倒亞種（Bacillus thuringiensis subsp.sotto）發(fā)酵生產(chǎn)微生物Bt殺蟲(chóng)效果明顯高于國(guó)內(nèi)應(yīng)用的菌株。因此有望推廣應(yīng)用[9]。

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