蔡玉笑，張志雯，秦素平，陳于和

(河北科技師范學(xué)院生命科技學(xué)院，河北秦皇島，066600)

實時熒光定量PCR(Real-time PCR)技術(shù)在檢測基因表達(dá)中起到重要的作用，其檢測結(jié)果靈敏性高，操作簡便，已被廣大科研人員所廣泛應(yīng)用［1，2］。但在具體操作過程中經(jīng)常出現(xiàn)重復(fù)性不穩(wěn)定的現(xiàn)象，這與引物的擴增效率有直接關(guān)系［3～6］。PPO包含2個銅離子保守結(jié)構(gòu)域，由細(xì)胞核基因編碼然后運輸?shù)劫|(zhì)體中。PPO的活性部位主要在N-結(jié)構(gòu)域，由酪氨酸修飾［7］。近年來，關(guān)于多酚氧化酶的生化特性和反應(yīng)機理的報道很多［8］。在菌類中，人們報道了很多關(guān)于PPO抑制劑，及其在生物工程及生物技術(shù)中可能的臨床應(yīng)用［9，10］。另外，對于多酚氧化酶蛋白二級結(jié)構(gòu)也有了新的研究，其結(jié)構(gòu)酷似軟體動物的血藍(lán)蛋白［11］。同時，人們對多酚氧化酶活性和生物抗逆性也有了很深的認(rèn)識，但在高粱幼苗中SbPPO的表達(dá)情況還不是很清楚，本試驗對高粱BTx623幼苗中的SbPPO家族的表達(dá)模式進(jìn)行了探索。

1 材料與方法

1．1 材料

挑選高粱品系BTx623籽粒大且飽滿的種子，在室溫下培養(yǎng)1周，提取總RNA，8種連有200～300 bp外源高粱多酚氧化酶基因的片段和一個Actin基因片段的pGEM-Teasy質(zhì)粒作為模板，用每一質(zhì)粒的特異引物進(jìn)行擴增。

1．2 引物設(shè)計

利用軟件Primer Premier 5在8個高粱籽粒多酚氧化酶基因和1個Actin基因的非保守區(qū)設(shè)計特異引物(表1)。

表1 特異引物

1．3 試劑

SYBR-Green購自Takara公司，Tripure購自羅氏公司，逆轉(zhuǎn)錄酶購自Promega公司。

1．4 質(zhì)粒濃度稀釋

將9種質(zhì)粒分別先稀釋到10－8ng/L。

分別各取2 μL質(zhì)粒定容到20 μL，將質(zhì)粒稀釋到10－9ng/L。

同樣的方法將9 種質(zhì)粒分別稀釋到 10－10，10－11，10－12ng/L。

1．5 熒光定量PCR反應(yīng)體系

在滅菌的 Eppendorf管中加入1 μL 模板，然后分別加入正反向引物0．3 μL，SYBR 10 μL 和8．4 μL滅菌的雙蒸水;以水為空白對照。

1．6 實時熒光定量PCR的擴增程序

根據(jù)熒光定量PCR儀(德國Hamburg公司Eppendorf5334型)的說明，設(shè)置35個實時熒光定量PCR反應(yīng)循環(huán)和適應(yīng)的退火溫度。

反應(yīng)程序:

步驟1 95℃預(yù)變性 2 min

步驟2 95℃變性 15 s

步驟3 合適的退火溫度 15 s

步驟4 回到步驟2 35個循環(huán)

步驟5 68℃ 20 min

以公式E=Power(10，－1/slope)－1計算引物的擴增效率。

1．7 總RNA提取與cDNA第一鏈的合成

1．7．1 應(yīng)用Tripure法提取總RNA 整株幼苗置于放有鋼珠的2 mL管中，加入液氮迅速用組織研磨器磨碎。

加入1 mL Tripure試劑，室溫放置5～10 min。

4℃，12 000 g離心10 min，取上清。加入200 μL氯仿，充分混勻，室溫放置5 min。

4℃，12 000 g離心10 min，取上清。加入500 μL異丙醇，輕輕上下混勻，室溫放置10 min。

4℃，12 000 g離心10 min，棄上清，體積分?jǐn)?shù)為0．70的乙醇洗滌沉淀2次，室溫干燥。

加入50 μL DEPC處理過的ddH2O，溶解沉淀。

檢測RNA的質(zhì)量，合格的RNA用于后續(xù)試驗。

1．7．2 cDNA第一鏈的合成 在滅菌的Eppendorf管中順序加入6 μL總RNA和3 μL oligo(dT)18(10 mmol/L)。

70℃水浴10 min，然后迅速置于冰上冷卻。

順序加入以下溶液:12 μL 5×逆轉(zhuǎn)錄緩沖液，6 μL dNTPs(10 mmol/L)，補水至總體積58 μL。

37℃溫育2 min。

加入2 μL M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，混勻，37℃反應(yīng)1 h。

反應(yīng)結(jié)束后，將離心管取出，70℃處理15 min滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。

反應(yīng)合成的cDNA第一鏈可用作PCR反應(yīng)的模板。

2 結(jié)果與分析

2．1 9對引物的標(biāo)準(zhǔn)曲線

9對引物分別擴增對應(yīng)一系列濃度梯度模板，以模板濃度拷貝數(shù)的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，以達(dá)到設(shè)定熒光閾值的循環(huán)數(shù)為縱坐標(biāo)繪制9對引物的標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)，該曲線可用于實時熒光定量PCR樣品中目的拷貝數(shù)的計算中。在本試驗中，其斜率可用于計算引物的擴增效率。

2．2 9對引物的擴增效率

不同的試驗前提下，對real-time PCR引物的擴增效率要求不同。9對引物的擴增結(jié)果以公式E=Power(10，－1/slope)－1計算引物的擴增效率(表2)。在相對定量中要求引物的擴增效率與內(nèi)參引物的擴增效率都接近于1，且相差不超過5%，可將PCR擴增效率默認(rèn)為100%，這樣將相對定量的計算公式就簡化為2－ΔΔCt。本試驗中引物1，引物4，引物7的引物擴增效率均接近于1，可以很好的用于下游試驗。

2．3 總RNA的質(zhì)量

各取1 μL RNA在紫外分光光度計下檢測OD260/280，OD260/230，排除基因組DNA和蛋白的污染。本試驗中OD260/280，OD260/230的比值均小于2．0，保證試驗結(jié)果的真實可靠(表3)。

在試驗中，RNA的降解會直接導(dǎo)致試驗結(jié)果的失真。各取1 μL RNA樣品，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，3條目的條帶清晰可見為質(zhì)量合格RNA，所提總RNA中未出現(xiàn)降解(圖2)。

表3 高粱幼苗總RNA的純度檢測

2．4 BTx623幼苗中多酚氧化酶基因的表達(dá)

本研究選用上述9對引物，以高粱看家基因SbActin(NCBI登錄號:X79378)的表達(dá)量為參照因子，利用計算公式2－ΔΔCt，幼苗中 SbPPO 的表達(dá)研究中發(fā)現(xiàn):SbPPO2，SbPPO5和SbPPO6的表達(dá)量較高;SbPPO3，SbPPO4，SbPPO8的表達(dá)量很低(圖3)。

本次試驗驗證了基因在功能上的分化，這與前人在研究其他物種的PPO的表達(dá)模式的結(jié)論相一致，即PPO一般以基因家族的形式存在，PPO的表達(dá)具有時間和空間上的特異性，同一物種中不同PPO家族成員的表達(dá)量也不相同。本次試驗嚴(yán)控幼苗的生長環(huán)境，保證無蟲害損傷等環(huán)境壓力。SbPPO2，SbPPO5和SbPPO6可能在幼苗的生長過程中起到重要的作用，需要進(jìn)一步的試驗證明。

圖3 SbPPO在高粱BTx623幼苗中的相對SbActin表達(dá)量

3 結(jié)論與討論

理論上PCR過程是以2n(n代表PCR反應(yīng)的循環(huán)數(shù))方式進(jìn)行擴增。但在實際反應(yīng)過程中，隨著反應(yīng)體系中各成分的消耗(主要是由于聚合酶活力的衰減)使得反應(yīng)并非按指數(shù)方式擴增，因此起始模板量與終點的熒光信號強度間沒有可靠的相關(guān)性。為了能準(zhǔn)確判斷樣品中某基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物(mRNA)的起始拷貝數(shù)，實時熒光定量PCR采用新的參數(shù)——Ct值(循環(huán)數(shù))，定量的基本原理是Ct值與樣品中起始模板的拷貝數(shù)的對數(shù)成線性反比關(guān)系。

Real-time PCR技術(shù)在使用過程中經(jīng)常會出現(xiàn)重復(fù)性差的問題，這與很多因素有關(guān)，諸如SYBR或者樣品的均一性，反應(yīng)體系的污染、PCR儀未經(jīng)校正、引物的特異性差以及擴增效率低等各種原因。其中引物的擴增效率是影響Real-time PCR重復(fù)性高低的重要因素。本次試驗以十倍稀釋法制備均一樣品，嚴(yán)格遵守試驗操作避免樣品污染，試驗數(shù)據(jù)3次重復(fù)，并根據(jù)質(zhì)粒樣品的分子量大小計算出樣品的拷貝數(shù)，用Excel處理數(shù)據(jù)。

本次研究中采用SYBR Green產(chǎn)生的熒光信號進(jìn)行樣品定量，在試驗前要求設(shè)計高質(zhì)量的特異性引物，在PCR反應(yīng)程序中增設(shè)融解曲線，可以較好的判斷引物的特異性。

本次試驗中以9對Real-time PCR特異性引物分別擴增不同的質(zhì)粒模板，檢測到引物1，引物4和引物7的擴增效率較好，接近于1;建立了一套較完備的檢測Real-time PCR引物擴增效率的體系。本次試驗中的數(shù)據(jù)均為3次獨立重復(fù)試驗的結(jié)果。結(jié)果證明本次試驗中的9對引物為特異性較好引物。

在前人的研究中發(fā)現(xiàn)PPO存在誘導(dǎo)及潛伏性［12］，本次試驗中發(fā)現(xiàn)在幼苗生長的早期SbPPO2，SbPPO5和SbPPO6的相對表達(dá)量較高，這可能是由于他們在高粱苗期中起到重要作用。前人研究發(fā)現(xiàn)多酚氧化酶一般存在于植物正在發(fā)育的幼嫩組織及分生組織中，其同一基因家族的每一個基因也有各自不同的時空表達(dá)模式，表明這些基因的功能不完全相同［12］。同時，這3個基因可能是高粱苗期的組成型PPO［13，14］，其它SbPPO可能是誘導(dǎo)型PPO。一般情況下，誘導(dǎo)型PPO充當(dāng)防御性抗?fàn)I養(yǎng)蛋白的功能，而組成型PPO具有防御昆蟲進(jìn)攻的作用［15］。Goodman等對其克隆的4個香蕉多酚氧化酶基因BPO1，BPO11，BPO34，BPO35做了表達(dá)分析，Northern雜交表明BPO1的表達(dá)量最高并且存在于果肉發(fā)育早期，而果皮中未檢測到;BPO1在未伸展的葉、花、根、莖中高度表達(dá)但在成熟葉片中檢測不到。BPO11只在幼齡的果肉中有mRNA信號，BPO34，BPO35在發(fā)育果實中無轉(zhuǎn)錄，在花和根中有微弱的信號，成熟葉片中只有BPO34表達(dá)。對其他植物PPO研究中也發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象［16，17，18］，與筆者的研究結(jié)果一致。

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