富硒靈芝超微粉抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)功能研究

李秋涵，洪志丹

目前，惡性腫瘤的主要治療方法包括外科手術(shù)、放療、化療等。具有免疫調(diào)節(jié)功能的中藥在鞏固和加強(qiáng)抗腫瘤藥的治療效果、延長(zhǎng)患者的生命和改善生存質(zhì)量方面顯現(xiàn)出了巨大的優(yōu)越性［1-2］。靈芝作為傳統(tǒng)中藥具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的作用，本文研究了富硒靈芝超微粉的抗腫瘤作用及其對(duì)機(jī)體免疫功能的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物 昆明種小鼠，體質(zhì)量18～22 g，雌雄兼有(每批試驗(yàn)用一種性別)，由中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào):SCXK(軍)2007-004。

1.2 瘤株及細(xì)胞株 肉瘤S180瘤株、肝癌H22瘤株，沈陽(yáng)市腫瘤研究所提供，昆明種小白鼠保種。

1.3 藥品與試劑 富硒靈芝超微粉，沈陽(yáng)德寰靈芝種植基地提供。室溫干燥處保存，臨用前用蒸餾水溶解并稀釋至所需濃度。參一膠囊，吉林亞泰制藥有限公司生產(chǎn);環(huán)磷酰胺(CTX)，上海華聯(lián)制藥有限公司。

1.4 主要儀器 FA/JA1004系列上皿電子天平:上海精科天平儀器廠(chǎng);PH050A型培養(yǎng)箱/干燥箱:上海一恒實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;XDS-1B型倒置生物顯微鏡:重慶光電儀器總公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 對(duì)小鼠移植性肉瘤S180生長(zhǎng)的影響 無(wú)菌操作，取傳代7d的荷S180小鼠腹水，細(xì)胞計(jì)數(shù)，用0.9%生理鹽水稀釋至濃度為2×107個(gè)/mL，每只小鼠右腋皮下接種0.2 mL。次日，按體質(zhì)量隨機(jī)分為5組，分別為富硒靈芝超微粉1.04、0.52、0.26 g/kg劑量組與陽(yáng)性對(duì)照組(市售參一膠囊5.2 mg/kg)、模型(對(duì)照)組。各給藥組連續(xù)給藥15d，模型對(duì)照組灌胃給予蒸餾水。約藥體積為20 mL/kg。末次給藥后24 h，頸椎脫臼處死動(dòng)物，分別稱(chēng)體質(zhì)量、瘤重，計(jì)算抑瘤率，進(jìn)行療效評(píng)價(jià)［3-4］。結(jié)果用Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3批。結(jié)果顯示，富硒靈芝超微粉劑量依賴(lài)性地抑制移植性肉瘤S180生長(zhǎng)，且給藥組小鼠體質(zhì)量穩(wěn)定增長(zhǎng)。見(jiàn)表1。

2.2 富硒靈芝超微粉對(duì)小鼠移植性肝癌H22生長(zhǎng)的影響 無(wú)菌操作，取傳代7d的荷肝癌H22小鼠腹水，細(xì)胞計(jì)數(shù)，用0.9%生理鹽水稀釋至濃度為2×107個(gè)/mL，每只小鼠右腋皮下接種0.2 mL(4×106個(gè)/只)。次日按體質(zhì)量隨機(jī)分為5組并給藥(給藥方法同“2.1”項(xiàng))。給藥體積為20 mL/kg。末次給藥后24 h，頸椎脫臼處死動(dòng)物，分別稱(chēng)體質(zhì)量、瘤重，計(jì)算抑瘤率，進(jìn)行療效評(píng)價(jià)［5］。結(jié)果用Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3批。結(jié)果顯示，富硒靈芝超微粉劑量依賴(lài)性地抑制移植性肝癌H22的生長(zhǎng)，且給藥組小鼠體質(zhì)量穩(wěn)定增 長(zhǎng)。見(jiàn)表2。

表1 富硒靈芝超微粉對(duì)小鼠移植性肉瘤S180生長(zhǎng)的影響(，n=3)

表1 富硒靈芝超微粉對(duì)小鼠移植性肉瘤S180生長(zhǎng)的影響(，n=3)

注:與模型組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01。抑瘤率=(模型組瘤重-給藥組瘤重)/模型組瘤重×100%

批次 組別 劑量(g/kg) 動(dòng)物數(shù)(只)體質(zhì)量(g)瘤重(g) 抑瘤率(%)開(kāi)始 結(jié)束 開(kāi)始 結(jié)束1 10 9 20.5±1.18 28.3±2.75 1.536±0.333參一膠囊組 5.2×10-3 10 10 20.3±1.36 28.8±2.89 1.023±0.265＊＊ 33.4富硒靈芝超微粉組 1.04 10 10 20.1±1.43 27.7±3.29 1.071±0.350＊＊ 30.3 0.52 10 10 19.6±0.79 26.1±1.91 1.123±0.313＊＊ 26.9 0.26 10 9 20.5±1.33 27.9±2.21 1.209±0.221* 21.3 2模型組 10 10 19.6±1.30 27.5±2.32 1.602±0.467參一膠囊組 5.2×10-3 10 10 19.5±0.88 27.0±1.84 1.040±0.572＊＊ 35.1富硒靈芝超微粉組 1.04 10 10 19.6±0.81 26.6±1.34 1.162±0.369＊＊ 27.5 0.52 10 10 19.0±0.83 26.5±1.33 1.305±0.488* 18.5 0.26 10 10 19.5±1.12 27.6±1.81 1.427±0.465 10.9 3模型組 10 10 19.8±0.69 26.9±2.69 1.745±0.659參一膠囊組 5.2×10-3 10 10 19.8±0.95 26.8±1.48 1.057±0.441＊＊ 39.4富硒靈芝超微粉組 1.04 10 10 19.2±0.81 27.4±1.28 1.203±0.421＊＊ 31.1 0.52 10 10 19.3±0.58 27.3±2.80 1.257±0.486* 27.9 0.26 10 10 19.5±0.89 26.4±1.17 1.457±0.438 16模型組.5

表2 富硒靈芝超微粉對(duì)小鼠移植性H22肝癌生長(zhǎng)的影響(±s，n=3)

表2 富硒靈芝超微粉對(duì)小鼠移植性H22肝癌生長(zhǎng)的影響(±s，n=3)

注:與模型組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01

批次 組別 劑量(g/kg) 動(dòng)物數(shù)(只)體質(zhì)量(g)瘤重(g) 抑瘤率(%)開(kāi)始 結(jié)束 開(kāi)始 結(jié)束1 10 9 19.7±0.73 25.7±2.73 1.678±0.724參一膠囊組 5.2×10-3 10 10 19.5±0.82 26.2±1.90 1.027±0.290＊＊ 38.8富硒靈芝超微粉組 1.04 10 10 19.3±0.65 26.9±1.52 1.106±0.413＊＊ 34.1 0.52 10 10 19.2±0.62 26.7±1.67 1.235±0.311* 26.4 0.26 10 10 19.7±0.79 25.5±1.83 1.476±0.459 12.0 2模型組 10 9 19.6±1.05 26.8±2.06 2.131±0.858參一膠囊組 5.2×10-3 10 10 19.4±1.11 26.2±2.07 1.264±0.695＊＊ 40.7富硒靈芝超微粉組 1.04 10 9 19.8±0.85 26.8±1.18 1.413±0.622＊＊ 33.7 0.52 10 10 19.7±0.91 26.2±1.58 1.652±0.563* 22.5 0.26 10 10 19.5±1.04 26.7±1.70 1.858±0.723 12.8 3模型組 10 10 20.1±1.36 27.6±2.94 2.089±0.647參一膠囊組 5.2×10-3 10 10 20.8±1.24 28.5±2.98 1.360±0.558＊＊ 34.9富硒靈芝超微粉組 1.04 10 10 20.2±1.32 26.5±3.24 1.441±0.537* 31.0 0.52 10 10 19.8±1.05 26.7±1.29 1.507±0.326* 27.8 0.26 10 10 20.2±1.37 27.9±2.85 1.750±0.654 16模型組.2

2.3 富硒靈芝超微粉對(duì)荷肉瘤S180小鼠脾臟及胸腺指數(shù)的影響 無(wú)菌操作，肉瘤S180的接種及分組同“2.1”，另設(shè)不接瘤的空白對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，頸椎脫臼處死小鼠，取其脾臟及胸腺，稱(chēng)重，計(jì)算脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)。脾臟(胸腺)指數(shù)=脾臟(胸腺)重量/體質(zhì)量 × 10［6］。各組結(jié)果用 Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。結(jié)果顯示，模型組小鼠脾臟及胸腺指數(shù)較空白對(duì)照組顯著降低;與模型對(duì)照組比較，富硒靈芝超微粉1.0、0.52 g/kg能夠顯著增強(qiáng)荷肉瘤S180小鼠的脾臟指數(shù)，富硒靈芝超微粉1.04 g/kg能夠顯著增強(qiáng)荷肉瘤S180小鼠的胸腺指數(shù)。見(jiàn)表3。

表3 富硒靈芝超微粉對(duì)荷肉瘤S180小鼠脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)的影響()

表3 富硒靈芝超微粉對(duì)荷肉瘤S180小鼠脾臟指數(shù)及胸腺指數(shù)的影響()

注:與模型組比較，*P＜0.05;與空白對(duì)照組比較，#P＜0.05

組別 劑量(g/kg)動(dòng)物數(shù)(只)脾臟指數(shù)(mg/10g)胸腺指數(shù)(mg/10g)10 129.6±24.04 37.3±9.28模型組 10 101.4±29.84# 29.5±4.94#富硒靈芝超微粉 1.04 10 134.4±24.29* 39.1±8.34*0.52 10 131.4±28.76* 35.1±6.93 0.26 10 104.8±21.81 33.5±6.72參一膠囊 5.2×10-310 132.8±24.30* 38.8±8.86空白對(duì)照組*

2.4 富硒靈芝超微粉對(duì)荷肝癌H22小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響 無(wú)菌操作，肝癌H22的接種及分組同“2.2”，另設(shè)不接瘤的空白對(duì)照組。于實(shí)驗(yàn)前3d，每只鼠腹腔注射0.2 mL 4%的淀粉生理鹽水溶液，誘發(fā)腹腔的無(wú)菌性炎癥。于實(shí)驗(yàn)日，頸椎脫臼處死小鼠，75%乙醇全身浸泡消毒，向小鼠腹腔內(nèi)注入5 mL預(yù)冷的PBS，腹部按摩，抽取腹腔細(xì)胞懸液約4 mL。將懸液轉(zhuǎn)入離心管中，1 500 r/min、4℃離心5 min，棄去上清，再用 PBS清洗1次。將細(xì)胞轉(zhuǎn)入盛有含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/mL。以100 μL/孔加入 96 孔板中，置 5%CO2、37 ℃ 培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h后，甩棄上清，用PBS清洗96孔板3次，將孔內(nèi)液體甩干。每孔加入0.075%的中性紅溶液100 μL，置5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng) 1 h，取出培養(yǎng)板，甩棄中性紅。用PBS清洗96孔板4次，加入乙醇∶冰醋酸(1∶1)100 μL，靜置過(guò)夜，用酶標(biāo)儀測(cè)540 nm處的OD值［7-8］。各組結(jié)果用Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。結(jié)果顯示，模型組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞體外吞噬中性紅的能力較空白對(duì)照組顯著降低;與模型組比較，富硒靈芝超微粉1.04、0.52 g/kg能夠顯著增強(qiáng)荷肝癌H22小鼠腹腔巨噬細(xì)胞體外吞噬中性紅的能力。見(jiàn)表4。

表4 富硒靈芝超微粉對(duì)荷肝癌H22小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響()

表4 富硒靈芝超微粉對(duì)荷肝癌H22小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響()

注:與模型組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與空白對(duì)照組比較，##P＜0.01

組別 劑量(g/kg) 動(dòng)物數(shù)(只)OD值(540 nm)10 0.552±0.085模型組 10 0.285±0.071##富硒靈芝超微粉 1.04 10 0.484±0.053＊＊0.52 10 0.352±0.068*0.26 10 0.203±0.027參一膠囊 5.2×10-3 10 0.435±0.054空白對(duì)照組＊＊

2.5 富硒靈芝超微粉對(duì)免疫功能低下小鼠血清溶血素水平的影響 選取健康昆明種小鼠60只，隨機(jī)分為6組，分別為富硒靈芝超微粉1.04、0.52、0.26 g/kg劑量組及參一膠囊5.2 mg/kg組、模型組(給予環(huán)磷酰胺)及空白對(duì)照組。各組連續(xù)給藥，于給藥第5天，給每只鼠腹腔注射5%雞紅細(xì)胞懸液0.2 mL。除空白對(duì)照組外，其余各組分別于第4天、第9天，按75 mg/kg劑量腹腔注射環(huán)磷酰胺，造成免疫功能低下模型。連續(xù)給藥10d，第11天進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。各組小鼠眼底靜脈叢取血，離心分離血清，用生理鹽水將血清稀釋50倍，取稀釋血清1 mL加入反應(yīng)管中，再加入0.5%雞紅細(xì)胞懸液0.5 mL，然后在冰水中加入0.5 mL補(bǔ)體(10%3只豚鼠混合血清)，將反應(yīng)管中溶液搖勻，置于37℃恒溫水浴中反應(yīng)30 min，反應(yīng)過(guò)程中振搖2次，反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)管置于0℃冰箱中終止反應(yīng)。離心，取上清液于722型分光光度計(jì)540 nm處比色，測(cè)定吸光度(以不加小鼠血清的空白對(duì)照管調(diào)0)，以上清液的吸光度代表小鼠血清溶血素水平的高低［9］。各組結(jié)果用Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。結(jié)果顯示，模型組小鼠血清溶血素水平較空白對(duì)照組顯著降低;與模型組比較，富硒靈芝超微粉1.04、0.52 g/kg能夠顯著提高小鼠的血清溶血素水平，改善環(huán)磷酰胺對(duì)小鼠血清溶血素水平產(chǎn)生的抑制作用。見(jiàn)表5。

表5 富硒靈芝超微粉對(duì)免疫功能低下小鼠血清溶血素水平的影響()

表5 富硒靈芝超微粉對(duì)免疫功能低下小鼠血清溶血素水平的影響()

注:與模型組比較，*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與空白對(duì)照組比較，##P＜0.01

組別 劑量(g/kg) 只 OD值(540 nm)空白對(duì)照組 —10 0.445±0.040模型組 CTX 75 mg/kg×2次 10 0.128±0.049##富硒靈芝超微粉+CTX 1.04 10 0.350±0.083＊＊0.52 10 0.259±0.091*0.26 10 0.100±0.030參一膠囊+CTX 5.2×10-3 10 0.354±0.078＊＊

3 討論

本文采用的移植性腫瘤模型，是考察藥物抗腫瘤作用的典型體內(nèi)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。模型的?yōu)點(diǎn)在于能夠保持機(jī)體的完整性，并使機(jī)體與外界環(huán)境保持正常的聯(lián)系，因此，能更加客觀地反映藥物的抗腫瘤活性［11］。本研究表明，富硒靈芝超微粉能夠顯著降低荷肉瘤S180、肝癌H22小鼠的平均瘤重，確定了其具有抗腫瘤活性。通過(guò)觀察免疫系統(tǒng)多個(gè)指標(biāo)的變化，考察了富硒靈芝超微粉對(duì)機(jī)體免疫功能的影響，結(jié)果表明，富硒靈芝超微粉通過(guò)影響免疫系統(tǒng)的不同環(huán)節(jié)而增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，從而產(chǎn)生抗腫瘤活性。

［1］孫燕.腫瘤藥物治療百年回顧與展望［J］.中華腫瘤雜志，2004，26(11):701-704.

［2］閻紅飛.扶正固本對(duì)放化療毒副反應(yīng)的減毒作用［J］.中國(guó)腫瘤，1999，8(10):451.

［3］徐叔云，卞如濂，陳修.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)［M］.第3版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2002:1757-1784.

［4］劉春英，董明，李淑玲，等.加味八珍湯對(duì)S180荷瘤小鼠的免疫抑瘤作用［J］.中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2003，10(7):30-31.

［5］葛迎春.人參皂苷Rh2注射液對(duì)荷肝癌H22小鼠免疫功能的影響［J］.特產(chǎn)研究，2002，(3):4-6.

［6］張秀軍，徐儉，林志彬，等.甲基茯苓多糖對(duì)小鼠免疫功能的影響［J］.中國(guó)藥學(xué)雜志，2002，37(12):913-916.

［7］劉藝萍.巨噬細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)［J］.國(guó)外醫(yī)學(xué):免疫學(xué)分冊(cè)，1998，21(4):207-210.

［8］薛燕，白金葉，程桂芳，等.參附注射液對(duì)免疫功能的影響［J］.中藥藥理與臨床，2001，17(1):8-10.

［9］苗立成，王立強(qiáng)，李良橋，等.蘆薈凝膠對(duì)小鼠免疫及抗腫瘤作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2003，19(2):87-90.

［10］梁軍，李子蓉，孫紀(jì)元，等.靈芝-912對(duì)小鼠移植性腫瘤的抑制作用［J］.中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2003，13(9):11-14.