防腐劑對地衣芽孢桿菌的抑制效果

陳 曉，柳艷霞，魏法山，李苗云，趙改名，高曉平，李青陽，孫靈霞，張秋會，田 瑋，張建威，黃現(xiàn)青,*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南省肉制品加工與質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002；2.河南省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，河南 鄭州 450004；3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

防腐劑對地衣芽孢桿菌的抑制效果

陳 曉1，柳艷霞1，魏法山2，李苗云1，趙改名1，高曉平1，李青陽3，孫靈霞1，張秋會1，田 瑋1，張建威1，黃現(xiàn)青1,*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，河南省肉制品加工與質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002；2.河南省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，河南 鄭州 450004；3.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

通過藥敏紙片法、最小抑菌質(zhì)量濃度(MIC)法測定地衣芽孢桿菌對不同防腐劑的敏感性，利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)篩選出最佳的防腐劑組合，并對獲得的最佳防腐劑組合的抑菌效果進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明：地衣芽孢桿菌對山梨酸鉀、乳酸鈉不敏感；對Nisin、ξ-聚賴氨酸和尼泊金乙酯較為敏感，在20mg/mL時(shí)其抑菌圈直徑分別為9.25、10mm和7.5mm，MIC分別為0.078、0.078mg/mL和2.5mg/mL。正交試驗(yàn)結(jié)果表明：當(dāng)Nisin、ξ-聚賴氨酸和尼泊金乙酯質(zhì)量濃度分別為0.313、0.313mg/mL和0.125mg/mL時(shí)，對地衣芽孢桿菌的抑制效果最佳，可使基質(zhì)中的地衣芽孢桿菌數(shù)(空白樣品中為5.48(lg(CFU/g))降低2(lg(CFU/mL))。選擇這一最佳組合分別對其在肉制品、乳制品、果汁中的應(yīng)用效果進(jìn)行測定，結(jié)果顯示在0～4℃條件下，復(fù)配防腐劑的效果較好。

防腐劑；地衣芽孢桿菌；菌落總數(shù)

肉及肉制品的營養(yǎng)極為豐富，是多種微生物良好的培養(yǎng)基，地衣芽孢桿菌是從肉中分離出的革蘭氏陽性芽孢桿菌，能產(chǎn)生蛋白分解酶，使動植物組織發(fā)生腐敗分解[1]，其在一定程度上可使肉表面顏色發(fā)暗，并產(chǎn)生難聞的臭味。由微生物引起的食品霉變、腐敗對人類的生產(chǎn)和生活帶來很大的影響，造成了巨大的損失[2]。為了穩(wěn)定食品的化學(xué)性質(zhì)，防止和抑制細(xì)菌的生長，必須在食品的加工過程中加入一系列食品防腐劑來延長保存期[3]。食品防腐劑不影響食品的味道，它可以抑制微生物的生長，殺死食品中含有的有害微生物，以此來防止影響食品保鮮的化學(xué)過程，例如發(fā)酵、霉變和腐敗等[4]。所以，添加食品防腐劑是防止食品腐敗變質(zhì)的重要手段之一。

目前，在食品工業(yè)中使用的防腐劑多為化學(xué)性防腐劑，雖然具有較強(qiáng)的抗菌作用，但其長期使用存在著一定的安全隱患，如有一定的毒副作用、對生態(tài)環(huán)境造成不利的影響等問題[5-6]。由于化學(xué)品食品防腐劑存在潛在的毒性，因此從自然資源中提取天熱防腐劑就成了亟待解決的問題[7]。生物防腐劑具有高效、無毒、適用性廣，性能穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，逐漸成為食品加工研究應(yīng)用的熱點(diǎn)[8]。并且，生物防腐劑的多年研究和應(yīng)用中均沒有發(fā)現(xiàn)微生物對生物防腐劑形成抗性，顯著提高了食品的安全性[9-10]。開展生物型防腐劑的復(fù)配應(yīng)用研究，以提高防腐效果、拓寬抗菌譜和降低成本，是今后生物型防腐劑研究的重要方向[11]。據(jù)此，本實(shí)驗(yàn)研究地衣芽孢桿菌對那他霉素、Nisin、山梨酸鉀、乳酸鈉、ξ-聚賴氨酸和尼泊金乙酯的敏感性，并通過正交試驗(yàn)優(yōu)化出復(fù)合防腐劑的最佳配方，并對其在肉品、乳品和果汁制品中的應(yīng)用效果進(jìn)行研究，旨為延長其貨架期提供研究基礎(chǔ)，為企業(yè)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生鮮豬里脊肉、獼猴桃、鮮奶(均不含防腐劑)均為市售。

Nisin、ξ-聚賴氨酸由浙江銀象生物工程有限公司惠贈；山梨酸鉀、乳酸鈉、尼泊金乙酯(均為食品級)；牛肉浸膏、蛋白胨 北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠；平板計(jì)數(shù)瓊脂 北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 菌種與培養(yǎng)基

地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)標(biāo)準(zhǔn)株購自中國科學(xué)院微生物所。

LB液體培養(yǎng)基：牛肉膏5g/L、蛋白胨10g/L、氯化鈉5g/L，pH7.2～7.4；LB固體培養(yǎng)基：在LB液體培養(yǎng)基中加入15g/L瓊脂粉；平板菌落計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基：稱取培養(yǎng)基23.5g，加入到1L蒸餾水中加熱煮沸溶解后分裝。以上培養(yǎng)基均在121℃滅菌15min[12]。

1.3 方法

1.3.1 敏感性實(shí)驗(yàn)研究

分別采用藥敏紙片法和最小抑菌質(zhì)量濃度法(MIC)測定地衣芽孢桿菌對各防腐劑的敏感性，具體操作參照文獻(xiàn)[13]進(jìn)行。

1.3.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，由藥敏紙片法確定出Nisin、ξ-聚賴氨酸、尼泊金乙酯3種敏感性較高的防腐劑作為正交試驗(yàn)的3個(gè)因素，由MIC法的結(jié)果確定出正交試驗(yàn)中3個(gè)因素各自的水平，設(shè)計(jì)三因素三水平正交試驗(yàn)，以篩選最優(yōu)的防腐劑復(fù)配組合。

1.3.3 實(shí)際樣品的檢測

利用優(yōu)化后的最佳配方，以新鮮里脊肉、鮮乳、獼猴桃汁為基質(zhì)，分別于25℃和0～4℃環(huán)境內(nèi)放置，25℃條件下每隔2d取樣測定1次，0～4℃條件下每隔5d取樣測定1次，計(jì)算樣品中的細(xì)菌總數(shù)，研究復(fù)合防腐劑對地衣芽孢桿菌的抑制效果。

1.4 菌落計(jì)數(shù)

參照GB/T 4789.2—2010《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定》中的平板傾注法[14]測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 藥敏紙片法測定結(jié)果

利用藥敏紙片法測定不同防腐劑對地衣芽孢桿菌抑菌圈的大小，確定地衣芽孢桿菌對不同防腐劑的敏感性，結(jié)果如表1所示，尼泊金乙酯、ξ-聚賴氨酸、Nisin對地衣芽孢桿菌有抑菌作用，在質(zhì)量濃度為20mg/mL時(shí)抑菌圈直徑分別是7.5、10mm和9.25mm。

表1 抑菌圈直徑Table 1 Inhibition zone diameters of different preservativesmm

2.2 最小抑菌質(zhì)量濃度法測定結(jié)果

以96孔微量酶標(biāo)板測定MIC，利用酶標(biāo)儀在492nm波長處測定吸光度，結(jié)果表明，尼泊金乙酯、ξ-聚賴氨酸和Nisin的MIC分別為2.5、0.078、0.078mg/mL?？紤]到它們在國標(biāo)中的限量[15]，最終確定用于正交試驗(yàn)中尼泊金乙酯的質(zhì)量濃度分別為0.25、0.125mg/mL和0.0625mg/mL，ξ-聚賴氨酸的質(zhì)量濃度分別為0.313、0.078mg/mL和0.02mg/mL，Nisin的質(zhì)量濃度分別為0.313、0.078mg/mL和0.02mg/mL。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，3種防腐劑的抑菌性由強(qiáng)至弱依次為ξ-聚賴氨酸＞Nisin＞尼泊金乙酯，最優(yōu)組合為A1B1C2。在此條件下，進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，其細(xì)菌總數(shù)為3.48(lg(CFU/mL))比基質(zhì)中地衣芽孢桿菌(5.48(lg(CFU/mL))降低2(lg(CFU/mL))，故確定用于實(shí)際樣品測定的最優(yōu)組合為A1B1C2，即Nisin 0.313mg/mL、ξ-聚賴氨酸0.313mg/mL、尼泊金乙酯0.125mg/mL。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal array design and results

2.4 樣品的測定結(jié)果

表3 不同食品介質(zhì)應(yīng)用實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Anti-Bacillus licheniformis effects of the optimal preservative combination in three different foods lg(CFU/g)

由表3可知，3種樣品無論在低溫還是在室溫貯藏，加入最佳復(fù)配防腐劑后均可有效地減緩細(xì)菌的增殖。在室溫條件下，原始菌數(shù)在104～106CFU/g條件下，獼猴桃汁、里脊肉、牛乳在經(jīng)過4d放置后，其中細(xì)菌數(shù)分別增長1.04、3.57、2.45(lg(CFU/g))。在0～4℃放置時(shí)，獼猴桃汁、里脊肉在放置5d后其細(xì)菌總數(shù)分別增長了1.18、0.29(lg(CFU/g))，而牛乳樣品中細(xì)菌總數(shù)不僅沒有增加反而降低了1.36(lg(CFU/g))。3種樣品的腐敗速度以肉糜最快，而獼猴桃汁最慢，可能與獼猴桃中含有豐富的VC、pH值較低等原因有關(guān)[16]。

3 結(jié) 論

Nisin、ξ-聚賴氨酸和尼泊金乙酯對地衣芽孢桿菌有較明顯的抑制作用，其最小抑菌質(zhì)量濃度分別為0.078、0.078mg/mL和2.5mg/mL。正交試驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)它們的質(zhì)量濃度分別為0.313、0.313mg/mL和0.125mg/mL時(shí)，可以使基質(zhì)中的地衣芽孢桿菌(空白樣品5.48(lg(CFU/mL)))降低2(lg(CFU/mL))，是最佳的復(fù)配方案。對實(shí)際樣品的檢測結(jié)果顯示，在0～4℃的條件下，復(fù)配防腐劑的效果較好，可使獼猴桃貯藏5d，使里脊肉和牛乳貯藏10d。

[1] 王長遠(yuǎn). 肉與肉制品中的微生物及其檢測[EB/OL]. http∶//www.foodmate.net/lesson/32/07.php. 2005-02-22.

[2] 肖燕清, 白衛(wèi)東, 錢敏. 我國食品防腐劑的發(fā)展現(xiàn)狀及對策[J]. 中國調(diào)味品, 2010(11)∶ 35.

[3] HOLLEY R A, PATEL D. Improvement in shelf-life and safety of perishable foods by plant essential oils and smoke antimicrobials[J]. Food Microbiolog, 2005, 22(4)∶ 273-292.

[4] MASLOWSKA J, WI D OCHA M. Thermal decomposition of some chemical compounds used as food preservatives and kinetic parameters of this process[J]. Journal of Thermal Analysis and Calorimetry, 2000, 60(1)∶ 305-312.

[5] 謝俊杰, 佘世望, 許揚(yáng), 等. 食品防腐新領(lǐng)域∶ 微生物天然防腐劑[J].食品科學(xué), 1999, 20(1)∶ 13-14.

[6] ABEE T, KROCKEL L, HILL C. Bacteriocins∶ modes of actions and potentials in food preservation and control of food poison[J]. Food Microbiology, 1995, 28(2)∶ 169-185.

[7] HOU Lixia, SHI Yonghui. Inhibition of foodborne pathogens by Hf-1, a novel antibacterial peptide from the larve of the housefly(Musca domestica)in medium and orange juice[J]. Food Control, 2007, 18(11)∶ 1350-1357.

[8] 張百剛, 張寶善. 生物防腐劑在食品加工中的應(yīng)用研究[J]. 食品研究與開發(fā), 2004, 25(6)∶ 127.

[9] BELEWU M A, BELEWU K Y, NKWUNONWO C C. Effect of biological and chemical preservatives on the shelf life of West African soft cheese[J]. African Journal of Biotechnology, 2005, 4(10)∶ 1076-1079.

[10] 高兆銀, 李敏, 胡美姣, 等. 殼聚糖涂膜對香蕉保鮮生理和防腐效果初步研究[J]. 浙江農(nóng)業(yè)科學(xué), 2007(3)∶ 278-280.

[11] 郝利萍, 夏延斌. 食品添加劑[M]. 北京∶ 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社, 2002.

[12] 王向陽, 管佳. 天然防腐劑對蘿卜干腐敗微生物的控制研究[J]. 中國調(diào)味品, 2008(11)∶ 35.

[13] 雷質(zhì)文. 肉及肉制品微生物監(jiān)測應(yīng)用手冊[M]. 北京∶ 中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2008∶ 397-402.

[14] GB/T 4789.2—2010菌落總數(shù)的測定[S].

[15] GB 2760—2007食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)[S].

[16] 徐幸蓮, 彭增起, 鄧桑貴. 食品原料學(xué)[M]. 北京∶ 中國計(jì)量出版社,2006∶ 116-120.

Inhibitory Effects of Different Preservatives onBacillus licheniformis

CHEN Xiao1，LIU Yan-xia1，WEI Fa-shan2，LI Miao-Yun1，ZHAO Gai-ming1，GAO Xiao-ping1，LI Qing-yang3，SUN Ling-xia1，ZHANG Qiu-hui1，TIAN Wei1，ZHANG Jian-wei1，HUANG Xian-qing1,*
(1. Henan Key Laboratory of Meat Processing and Quality Safety Control, College of Food Science and Technology,Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China；2. Henan Province Product Quality Supervision and Inspection Center,Zhengzhou 450004, China；3. College of Life Sciences, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China)

The sensitivity ofBacillus licheniformisto different preservatives was tested by disk diffusion method and minimum inhibitory concentration (MIC) assay. The optimal combination of preservatives againstBacillus licheniformiswas determined using orthogonal array design method and validated. The results showed thatBacillus licheniformiswas not sensitive to natamycin, sorbic acid, potassium and sodium lactate, but sensitive to nisin,ε-polylysine and ethylparaben, revealing an inhibition zone diameter of 9.25, 10 mm and 7.25 mm and an MIC of 0.078, 0.078 mg/mL and 2.5 mg/mL, respectively. The combination of nisin,ε-polylysine and ethylparaben at respective concentrations of 0.313, 0.313 mg/mL and 0.125 mg/mL showed the best inhibitory effect onBacillus licheniformiswith a 2(lg(CFU/g)) decrease 5.48(lg(CFU/g)) for the blank sample.Furthermore, the preservative combination indicated better inhibitory effect onBacillus licheniformisin meat products, dairy products and juice during storage at 0－4 ℃.

preservatives；Bacillus licheniormis；total plate count

TS201.3

A

1002-6630(2012)03-0089-03

2011-03-28

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目(200903012)；河南省基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃項(xiàng)目(082300430050)

陳曉(1989—)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)槿馄房茖W(xué)與食品微生物。E-mail：810906070@qq.com

*通信作者：黃現(xiàn)青(1977—)，男，副教授，博士，研究方向?yàn)槿馄房茖W(xué)與食品微生物。E-mail：hxq8210@126.com