高效液相色譜法測定四環(huán)素片的含量

廣東省韶關(guān)市食品藥品檢驗所（512028）嚴(yán)曉明 朱興保 劉旺培

廣東省韶關(guān)市皮膚病醫(yī)院（512000）李志林

四環(huán)素片是具有廣譜抑菌作用（高濃度時具殺菌作用）的四環(huán)素類抗生素口服制劑，是目前生產(chǎn)和臨床應(yīng)用最久的抗生素之一，對革蘭氏陰性菌和陽性菌均有抑制作用，臨床上多用于呼吸道、腸道、泌尿道感染。衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)[1]收載的四環(huán)素片的含量測定方法為中國藥典規(guī)定的抗生素微生物檢定法，該方法檢驗周期長，準(zhǔn)確度差，操作繁瑣，影響因素較多，不能滿足批量生產(chǎn)質(zhì)量控制的需要。因此，筆者采用高效液相色譜法取代效價法測定四環(huán)素片的含量，檢驗周期短、結(jié)果準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好、穩(wěn)定性好，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

Agilent 1200高效液相色譜系統(tǒng)（美國安捷倫公司），包括G1322A 真空脫氣機，G1311A四元泵，G1329A自動進樣器，G1316A柱溫箱，G1314B可變波長紫外檢測器；鹽酸四環(huán)素對照品（中國藥品生物制品檢定所，含量為88.2%，批號為130488-200403）；四環(huán)素片和四環(huán)素陰性對照品（廠家提供，樣品批號分別為20100803，20100903，20101003，規(guī)格為0.25g）；水為純化水，甲醇為色譜純，磷酸為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：SUPELCO Discovery C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：0.1%磷酸-甲醇（40∶60）；流速：1.0ml/min；柱溫：30℃；檢測波長：268nm；進樣量：10μl。

2.2 溶液制備 精密稱定鹽酸四環(huán)素對照品10.13mg，置于100ml容量瓶中，用0.1mol/L鹽酸溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對照品溶液。取四環(huán)素片10片，精密稱定，研細，精密稱取0.1488g（約相當(dāng)于四環(huán)素100mg），置于200ml容量瓶中，用0.1mol/L鹽酸溶液溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密吸取濾液10ml，置于50ml容量瓶中，用0.1mol/L鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。取不含四環(huán)素的陰性對照品，按供試品溶液制備方法制成陰性對照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察 系統(tǒng)適用性試驗：取2.2項下3種溶液，按擬訂方法進行測定。結(jié)果顯示，陰性對照品溶液在與對照品溶液色譜峰相應(yīng)保留時間位置上未出現(xiàn)吸收峰，由此可見，其他成分對四環(huán)素測定無干擾，四環(huán)素的保留時間約為3min，理論板數(shù)按四環(huán)素峰計算不低于10000，該方法專屬性良好。

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取對照品溶液1，2.5，5，10，20，40，80μl注入液相色譜儀中，記錄色譜圖，測定峰面積（見附圖）。以進樣量為橫坐標(biāo)X、峰面積為縱坐標(biāo)Y作圖，得線性回歸方程Y=2309.03X+332.64，r=0.9983（n=7）。結(jié)果表明，四環(huán)素進樣量在0.1～8.0μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗 精密吸取對照品溶液10μl，重復(fù)進樣6次，結(jié)果顯示，峰面積平均值為2619.33，RSD為0.22%（n=6），這表明儀器精密度良好。

2.6 重現(xiàn)性試驗 取同一批號樣品，依供試品溶液制備方法制備6份供試品溶液，分別測定峰面積，計算四環(huán)素含量。結(jié)果測得平均含量為95.66%，RSD為0.35%（n=6），試驗結(jié)果表明該法重現(xiàn)性良好。

附表 四環(huán)素加樣回收試驗測定結(jié)果(n=6)

2.7 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液10μl，依法分別于0，2，4，6，8，10，12h進樣，記錄色譜峰面積。結(jié)果RSD為0.52%（n=6），試驗結(jié)果表明，供試品溶液在室溫條件下12h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收試驗 精密稱取已知含量的樣品6份，分別精密加入一定量鹽酸四環(huán)素對照品，按供試品溶液制備方法制備，依法測定，計算回收率，結(jié)果見附表。

2.9 樣品含量測定 取3批樣品，依法制備供試品溶液，精密吸取10μl，測定峰面積，按外標(biāo)法計算含量。結(jié)果顯示，高效液相色譜法所測樣品中四環(huán)素含量分別為93.35%，93.78%，93.53%，中國藥典2010年版[2]收載的微生物檢定法所測樣品中四環(huán)素含量分別為93.46%，93.82%，93.69%。

3 討論

3.1 檢測波長的選擇 取鹽酸四環(huán)素對照品用0.1mol/L鹽酸溶液溶解并制成每1ml中含1mg的溶液，在200nm～400nm的波長范圍內(nèi)掃描，由色譜圖看出，四環(huán)素在218nm，268nm，355nm處有典型最大吸收，考慮儀器末端吸收和線性范圍關(guān)系，選擇268nm為檢測波長[2]。

3.2 本方法出峰時間為3min，在5min內(nèi)可完成一次測定，這明顯使檢驗周期縮短，工作效率提高?？蛇m當(dāng)調(diào)整流動相的比例以及流速，以使色譜主峰與相鄰的雜質(zhì)峰有良好的分離度。

3.3 用0.1%磷酸-甲醇（40∶60）作流動相進行雜質(zhì)分離預(yù)試驗，即取鹽酸四環(huán)素對照品和4-差向四環(huán)素、差向脫水四環(huán)素、鹽酸金霉素及脫水四環(huán)素對照品的混合溶液10μl注入液相色譜儀測定。結(jié)果表明，各組分的分離度均符合要求，說明雜質(zhì)對含量測定無干擾。

3.4 用HPLC法測定四環(huán)素的含量，與微生物檢定法進行比較，測定結(jié)果二者基本一致。并且HPLC法準(zhǔn)確度高，靈敏性好，簡單易行，有利于縮短檢驗周期，提高工作效率，可用于四環(huán)素片的質(zhì)量控制。